FACS AriaⅢ細(xì)胞分選參數(shù)選擇及條件優(yōu)化

沈鏈鏈， 劉艷青， 管強(qiáng)東

(南京醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院， 江蘇 南京 211166)

流式細(xì)胞分選(Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)是一項(xiàng)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的細(xì)胞分離與純化技術(shù)[1]。目前常規(guī)細(xì)胞分選除了流式細(xì)胞分選技術(shù)外，還有密度梯度離心法和免疫磁珠分離法。相對(duì)于其他兩種技術(shù)，流式細(xì)胞分選技術(shù)具有高通量、分選速度快、分選細(xì)胞純度高活性好等技術(shù)優(yōu)勢[2-4]。隨著細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀已成為科研領(lǐng)域和臨床診斷中不可缺少的設(shè)備[5]。在PubMed上使用“Fluorescence-activated cell sorting”作為關(guān)鍵詞檢索文獻(xiàn)，有關(guān)流式細(xì)胞分選方面的文獻(xiàn)與日俱增，如圖1所示，由此可見流式細(xì)胞分選儀得到了越來越多使用和研究。

圖1 PubMed上檢索“Fluorescence-activated cell sorting”文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)Fig.1 Search for “Fluorescence-activated cell sorting” literature statistics on PubMed

流式細(xì)胞分選儀在實(shí)際運(yùn)行中受到多種因素的制約，如儀器性能、操作手法和細(xì)胞狀態(tài)[1, 6]，并且分選的每個(gè)步驟和儀器參數(shù)的設(shè)置都會(huì)對(duì)細(xì)胞的活性、純度以及分選速度產(chǎn)生較大影響[7]。目前有研究報(bào)道不同型號(hào)的噴嘴以及分選模式均會(huì)對(duì)細(xì)胞的純度及活性有較大的影響[2, 8-9]。分選主要分為試管式分選和96孔板分選，對(duì)于試管式分選來說，得率、純度和活性這3個(gè)主要評(píng)價(jià)指標(biāo)很難同時(shí)兼顧，應(yīng)根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求采用不同的分選方案。對(duì)于96孔板分選來說，單細(xì)胞入孔率和克隆形成率是2個(gè)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，已有研究表明不同分選條件對(duì)單細(xì)胞入孔率和克隆形成率有較大影響[8]，同一條件下對(duì)于不同樣本的單細(xì)胞入孔率和克隆形成率也有較大差異[10]，應(yīng)采用合適的分選方案才能同時(shí)保證單細(xì)胞入孔率和克隆形成率。

樣本的制備(主要是細(xì)胞濃度及狀態(tài)、活性)，流式細(xì)胞儀參數(shù)、噴嘴尺寸的選擇是保障高分選效率和高分選純度的重要因素，但這需要豐富的經(jīng)驗(yàn)和一定的技巧，而目前相關(guān)報(bào)道很少，只有一些理論或經(jīng)驗(yàn)之談，缺乏系統(tǒng)的研究。因此，有必要結(jié)合實(shí)際情況系統(tǒng)地研究各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)分選產(chǎn)生的影響，結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)針對(duì)不同的樣本及需求制定符合實(shí)際工作且高效個(gè)性化的分選方案，為后續(xù)工作提供高質(zhì)量符合要求的細(xì)胞。胃癌細(xì)胞BGC-823是一種低分化的并且被廣泛使用的貼壁上皮樣細(xì)胞，其大小適中、狀態(tài)穩(wěn)定、可傳代次數(shù)好。因此文章以BGC-823細(xì)胞為例，探索流式細(xì)胞分選的參數(shù)選擇和條件優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材 料

FACS AriaⅢ流式細(xì)胞分選儀，Accudrop微球和鞘液(均為美國Becton Dickinson公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；胰酶、培養(yǎng)基以及細(xì)胞培養(yǎng)所需材料(均為美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方 法

1.2.1 樣品制備

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)的BGC-823細(xì)胞用胰酶消化，離心后用無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度分別調(diào)整為1×106，5×106，1×107個(gè)/mL，用篩孔尺寸為50 μm的濾網(wǎng)過濾于流式管中。

1.2.2 儀器調(diào)試

打開儀器開關(guān)以及電腦軟件，安裝提前超聲處理過的85 μm或100 μm噴嘴，點(diǎn)擊Stream啟動(dòng)主液流，液流穩(wěn)定后調(diào)節(jié)振幅Ampl和頻率Freq，使液流斷點(diǎn)處于窗口中上部，并使Gap值趨于穩(wěn)定。點(diǎn)擊Sweet Spot鍵，使液流穩(wěn)定在設(shè)定狀態(tài)。配制Accudrop微球，點(diǎn)擊Auto Delay自動(dòng)調(diào)試液滴延遲時(shí)間，側(cè)液流液滴比例99%以上為最佳。

1.2.3 96孔板單細(xì)胞分選

在Device Setup界面選擇96孔板，并點(diǎn)擊Go to Home鍵使載物臺(tái)移動(dòng)到默認(rèn)位置，加裝96孔板，調(diào)節(jié)左側(cè)液流使其從防濺孔中心穿過并落在A1孔蓋板中心位置，若未落在A1孔中心，則對(duì)載物臺(tái)位置進(jìn)行調(diào)節(jié)。為了精確定位，還需將細(xì)胞預(yù)分選到孔板蓋上，選取96孔板每一排的前中后3個(gè)孔，每個(gè)孔分選50個(gè)細(xì)胞，分選完后觀察蓋板上的液滴是否在每個(gè)孔的中心位置，若不在則需要微調(diào)載物臺(tái)位置。位置調(diào)節(jié)完后，取下蓋板，每個(gè)孔預(yù)先加入150 μL培養(yǎng)液，用single cell模式每個(gè)孔分選1個(gè)細(xì)胞。用同樣方法對(duì)85 μm和100 μm噴嘴，以及不同濃度1×106，5×106，1×107個(gè)/mL的細(xì)胞進(jìn)行分選。分選完成后，立刻蓋上蓋板，4 h后，在熒光顯微鏡下觀察微孔中細(xì)胞群落中綠色熒光較亮的單個(gè)細(xì)胞的孔數(shù)，再放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7 d后觀察克隆形成的情況。

1.2.4 試管式分選

安裝試管分選架，在流式管中提前加入1 mL培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)側(cè)液流電壓使側(cè)液流正好落在流式管中液面的中心位置。先用85 μm和100 μm兩種不同噴嘴進(jìn)行分選，后對(duì)1×106，5×106，1×107個(gè)/mL 3種濃度以及用4-way purity，purity，yield，initial和fine tune 5種模式進(jìn)行分選。每一次分選均分出1×105個(gè)細(xì)胞，記錄分選時(shí)間，分選完后按照檢測設(shè)門的條件回測細(xì)胞純度(記錄5 000個(gè)細(xì)胞)，將剩余細(xì)胞均勻地鋪在60 mm的培養(yǎng)皿中放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7 d后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 噴嘴的選擇

不同直徑的噴嘴對(duì)96孔板分選的單細(xì)胞入孔率和克隆形成率都有一定影響，以及對(duì)試管式分選的純度和活性也有影響。不同噴嘴分選后結(jié)果見表1，分選培養(yǎng)后細(xì)胞狀態(tài)如圖2所示。用85 μm噴嘴進(jìn)行96孔板分選時(shí)平均單細(xì)胞入孔率為(72.9±1.8)%，平均克隆形成率為(46.2±3.9)%，進(jìn)行試管式分選后平均純度為(71.3±1.8)%，培養(yǎng)7 d后細(xì)胞形態(tài)完整，有克隆形成，熒光相對(duì)較弱；用100 μm噴嘴進(jìn)行96孔板分選時(shí)平均單細(xì)胞入孔率為(74.6±1.6)%，平均克隆形成率為(54.0±1.8)%，進(jìn)行試管式分選后平均純度為(81.1±1.7)%，培養(yǎng)7 d后細(xì)胞狀態(tài)較好，細(xì)胞數(shù)量較多，熒光較強(qiáng)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

表1 不同噴嘴分選后結(jié)果比較Table 1 Comparison of the results of different nozzles after sorting

(a) 85 μm

(b) 100 μm圖2 85 μm噴嘴和100 μm噴嘴試管式分選培養(yǎng)后細(xì)胞狀態(tài)Fig.2 Cell states after different nozzle test-tube sorting and culture with 85 μm and 100 μm nozzle

2.2 細(xì)胞濃度的選擇

不同濃度的細(xì)胞對(duì)分選的效率和純度有一定的影響。對(duì)濃度為1×106個(gè)/mL細(xì)胞進(jìn)行96孔板分選時(shí)，平均單細(xì)胞入孔率為(74.6±2.6)%，平均克隆形成率為(56.3±2.1)%，進(jìn)行試管式分選后平均純度為(82.4±1.2)%，分選時(shí)間為(24.7±1.3) min，培養(yǎng)7 d后細(xì)胞狀態(tài)較好，克隆形成較多，熒光較強(qiáng)；對(duì)濃度為5×106個(gè)/mL細(xì)胞進(jìn)行96孔板分選時(shí)平均單細(xì)胞入孔率為(74.6±1.6)%，平均克隆形成率為(54.0±1.8)%，進(jìn)行試管式分選后平均純度為(81.1±1.7)%，分選時(shí)間為(5.0±0.5) min，培養(yǎng)7 d后細(xì)胞狀態(tài)較好，克隆形成較多，熒光較強(qiáng)；對(duì)濃度為1×107個(gè)/mL細(xì)胞進(jìn)行96孔板分選時(shí)平均單細(xì)胞入孔率為(70.5±2.2)%，平均克隆形成率為(52.7±1.8)%，進(jìn)行試管式分選后平均純度為(77.6±1.7)%，分選時(shí)間為(3.3±0.2) min，培養(yǎng)7 d后細(xì)胞狀態(tài)較好，有克隆形成，熒光較弱。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，見表2和圖3。

表2 不同濃度細(xì)胞分選后結(jié)果比較Table 2 Comparison of the results of different concentrations of cells after sorting

(a) 1×106個(gè)/mL

(b) 5×106個(gè)/mL

(c) 1×107個(gè)/mL圖3 不同濃度細(xì)胞試管式分選培養(yǎng)后的細(xì)胞狀態(tài)Fig.3 Cell states at different concentrations after test-tube sorting and culture

2.3 試管式分選模式的選擇

不同的分選模式影響分選效率和分選純度。用4-way purity，purity，yield，initial和fine tune 5種模式進(jìn)行分選后平均純度分別為(81.1±1.7)%，(80.4±1.1)%，(77.3±2.5)%，(76.4±1.0)%，(80.6±1.4)%。培養(yǎng)7 d后，4-way purity，purity和fine tune 3種模式細(xì)胞狀態(tài)較好，克隆形成較多，熒光較強(qiáng)；yield和initial 2種的模式細(xì)胞形態(tài)完整，有克隆形成，但熒光較弱。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，見表3和圖4。

表3 不同分選模式細(xì)胞分選后結(jié)果比較Table 3 Comparison of the results of different sorting modes after cell sorting

(a) 4-way purity

(b) Purity

(c) Yield

(d) Initial

(e) Fine tune圖4 不同分選模式試管式分選培養(yǎng)后細(xì)胞狀態(tài)Fig.4 Cell states in different sorting mode after test-tube sorting and culture

3 討 論

流式細(xì)胞分選技術(shù)以高通量、耗時(shí)短、多參數(shù)、無污染等優(yōu)勢被廣泛用于細(xì)胞的分選和純化，其分選后的細(xì)胞能繼續(xù)培養(yǎng)或者直接用于移植、提取核酸、原位雜交、單細(xì)胞PCR擴(kuò)增等[9, 11-13]。流式細(xì)胞分選儀是通過振蕩的噴嘴將液流分裂成均勻的小液滴，原則上每個(gè)液滴只包含一個(gè)細(xì)胞，通過儀器的多參數(shù)設(shè)置，包含目的細(xì)胞的液滴可被充以正負(fù)電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)電壓偏轉(zhuǎn)板時(shí)發(fā)生偏轉(zhuǎn)落入微孔板或收集管中[5, 14]。

流式細(xì)胞分選的結(jié)果受多種因素的影響，如儀器的狀態(tài)、樣品的狀態(tài)、噴嘴的選擇和分選模式的選擇。儀器狀態(tài)對(duì)分選結(jié)果影響較大的主要有液流的連續(xù)性和穩(wěn)定性以及液滴延遲的調(diào)節(jié)。液流的不穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)不當(dāng)會(huì)使儀器無法正確抓取目標(biāo)細(xì)胞，從而降低分選效果。為保證液流的連續(xù)性和穩(wěn)定性應(yīng)做到以下幾點(diǎn)：每次開機(jī)前，首先要檢查鞘液過濾器，若過濾器中有氣泡應(yīng)先排除氣泡，若過濾器堵塞要及時(shí)更換；其次要對(duì)噴嘴進(jìn)行超聲清洗防止噴嘴小孔堵塞，安裝噴嘴時(shí)保證O型密封圈的密封性，不要大幅度上下移動(dòng)；清潔電壓偏轉(zhuǎn)板確保無鹽結(jié)晶殘留；觀察流動(dòng)室有無氣泡，若有氣泡可以反復(fù)開關(guān)液流啟動(dòng)按鈕排除氣泡；根據(jù)不同的噴嘴設(shè)定準(zhǔn)確適當(dāng)?shù)恼穹鵄mpl和頻率Freq值；開啟液流后要使液流穩(wěn)定30 min，排除環(huán)境因素導(dǎo)致的液流不穩(wěn)定。液滴延遲是細(xì)胞從被檢測到被分選所經(jīng)過的時(shí)間差，要實(shí)現(xiàn)精確的分選，則必須得到準(zhǔn)確的液滴延遲值。雖然FACS AriaⅢ流式細(xì)胞分選儀具備自動(dòng)調(diào)試液滴延遲的功能，但在調(diào)試前應(yīng)使4路模擬分選液流能被激光均等照亮，否則會(huì)使分液流和中心液流照度不同，從而影響液滴延遲的設(shè)置[1]。

噴嘴的選擇是分選的基礎(chǔ)，一般要求噴嘴的直徑為樣本細(xì)胞直徑至少3倍以上，小噴嘴對(duì)應(yīng)的流速和振蕩頻率較大，形成的液滴小而多，可能存在液滴對(duì)細(xì)胞包裹不全的情況，導(dǎo)致分選后細(xì)胞受損甚至形成細(xì)胞碎片；大噴嘴形成的液滴較大，分選時(shí)形成的鞘液壓力更低，但是會(huì)存在一個(gè)液滴包裹多個(gè)細(xì)胞的情況，在某些分選模式下會(huì)影響細(xì)胞的回收率。綜合考慮之下，85 μm和100 μm噴嘴使用較多，研究中探討這兩種噴嘴對(duì)BGC-823細(xì)胞分選的影響。85 μm和100 μm噴嘴單細(xì)胞入孔率都在70%以上且沒有差異，但是85 μm噴嘴克隆形成率只有46.2%，相對(duì)較低。這可能和鞘液的壓力有關(guān)，85 μm噴嘴的鞘液壓力為0.31 MPa，而100 μm噴嘴的鞘液壓力只有0.17 MPa，大的鞘液壓力影響了細(xì)胞活性從而會(huì)導(dǎo)致克隆形成率的下降。用85 μm噴嘴進(jìn)行試管式分選后的細(xì)胞純度只有71.3%，相對(duì)100 μm噴嘴的81.1%較低。大的鞘液壓力不僅會(huì)使細(xì)胞活性降低甚至?xí)共糠旨?xì)胞受損從而形成細(xì)胞碎片導(dǎo)致分選后純度降低。

樣本的制備(主要是細(xì)胞濃度及狀態(tài)、活性)對(duì)細(xì)胞分選的結(jié)果也起著關(guān)鍵性作用。有研究發(fā)現(xiàn)濃度越小的細(xì)胞懸液，其液流越穩(wěn)定，并且單位時(shí)間內(nèi)有更少的細(xì)胞被檢測，提高了細(xì)胞檢測的靈敏度，從而提高了分選的效率和純度[8, 15]。研究探討1×106，5×106，1×107個(gè)/mL 3種濃度對(duì)BGC-823細(xì)胞試管式分選和微孔板分選的影響。3種濃度對(duì)微孔板分選結(jié)果影響不大，單細(xì)胞入孔率都在70%以上，克隆形成率都在50%以上，這可能與分選模式有關(guān)，微孔板分選一般選用single cell模式，這種模式可以準(zhǔn)確分選計(jì)數(shù)并且能更好地分選只包含單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞的液滴。但對(duì)試管式分選來說分選后細(xì)胞純度存在差異，細(xì)胞濃度越高分選后細(xì)胞的純度越低，高濃度的細(xì)胞液流越不穩(wěn)定，并且細(xì)胞越容易聚集從而進(jìn)一步影響分選結(jié)果。然而并不是細(xì)胞濃度越低越好，對(duì)于1×106個(gè)/mL和5×106個(gè)/mL這2種濃度的細(xì)胞來說，分選后細(xì)胞純度差別并不大，但是分選所用時(shí)間相差很大，1×106個(gè)/mL濃度的細(xì)胞分選需要24.7 min，而5×106個(gè)/mL濃度細(xì)胞分選只要5.0 min，綜合考慮選用5×106個(gè)/mL濃度細(xì)胞進(jìn)行分選能在保證純度的前提下大大提高了分選效率。除細(xì)胞濃度外，細(xì)胞的狀態(tài)和活性對(duì)分選結(jié)果也有一定影響，分選對(duì)樣本的要求是高活性、低雜質(zhì)、少聚集的單細(xì)胞懸液。因此最好選用新復(fù)蘇的、處于對(duì)數(shù)生長期并且活性好的細(xì)胞。在黏附細(xì)胞的單細(xì)胞樣本準(zhǔn)備時(shí)，需要用胰酶消化使細(xì)胞黏附降低從而分離，在此消化過程中時(shí)間過長或過短都會(huì)影響細(xì)胞樣品的質(zhì)量，對(duì)于容易聚集的黏附力強(qiáng)的細(xì)胞，可以適當(dāng)加入EDTA來有效防止細(xì)胞的聚集。

FACS AriaⅢ流式細(xì)胞分選儀具有6種分選模式，分別是single cell，4-way purity，purity，yield，initial和fine tune，每種模式對(duì)應(yīng)著不同的算法。single cell模式能準(zhǔn)確分選計(jì)數(shù)，適用于微孔板分選。purity和4-way-purity模式是保證純度的模式，他們只對(duì)包含目的細(xì)胞的液滴進(jìn)行分選，而對(duì)摻有非目的細(xì)胞的液滴不進(jìn)行分選，這可能導(dǎo)致細(xì)胞回收率的下降。purity常用于2路分選；4-way-purity常用于4路分選，能避免中間2路純度受影響；yield模式更注重于細(xì)胞的回收率，會(huì)使非目標(biāo)細(xì)胞誤選，導(dǎo)致分選的純度較低；initial模式為drop delay設(shè)定粗調(diào)模式；fine tune為drop delay設(shè)定細(xì)調(diào)模式。本研究中4-way purity，purity和fine tune這3種模式細(xì)胞分選后純度較高，而yield和initial模式細(xì)胞分選后純度相對(duì)較低。分選模式根據(jù)分選的目的來定，一般高富集實(shí)驗(yàn)要求高純度的，多選用4-way purity或purity模式，對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)純度要求不高并且細(xì)胞數(shù)較少的情況下，為保證細(xì)胞回收率可以選擇yield模式。

4 結(jié) 論

對(duì)于和BGC-823細(xì)胞大小類似的貼壁腫瘤細(xì)胞而言，96孔板分選可采用100 μm噴嘴和5×106個(gè)/mL細(xì)胞濃度能獲得更高的單細(xì)胞入孔率和克隆形成率；而對(duì)于試管式分選采用100 μm噴嘴、5×106個(gè)/mL細(xì)胞濃度和4-way purity模式將獲得更高的分選后細(xì)胞純度。研究以BGC-823細(xì)胞分選條件的優(yōu)化為例，為FACS Aria Ⅲ流式細(xì)胞分選儀細(xì)胞分選參數(shù)的選擇以及條件的優(yōu)化提供了一定的參考，為后續(xù)工作開展及順利進(jìn)行做充分保障。