甘草素對B16F10細胞中黑色素合成作用研究

呂金鵬， 姜松周， 李思淇， 張錫梅， 楊 瑩， 宋國強

(常州大學(xué) 藥學(xué)院， 江蘇 常州 213164)

皮膚黑色素在人們正常社會交往和保護人們免受紫外線輻射等方面發(fā)揮著重要的作用[1-2]。黑色素產(chǎn)生于黑色素細胞中的黑色素小體，黑色素成熟之后，由黑色素細胞的樹突端傳遞到周圍的角質(zhì)層形成細胞，完成皮膚著色[3-4]。與色素合成有關(guān)的3種關(guān)鍵酶分別為酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1(TRP-1)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2(TRP-2)[5-6]。其中TYR是黑色素生成的限速酶，能夠催化生成3,4-二羥基苯丙氨酸(DOPA)，TRP-1能與磷酸化的酪氨酸酶形成復(fù)合體，可對酪氨酸酶的激活起穩(wěn)定作用，TRP-2作為多巴胺互變異構(gòu)物，催化多巴胺重排形成5,6-二羥基吲哚-2-羧酸 (DHICA)[7]。在轉(zhuǎn)錄水平上小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子(MITF)通過啟動子區(qū)的M-box促進TYR的表達[8]，促進黑色素細胞的增殖和存活[9]。在黑色素細胞中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族，包括p38，ERK和JNK 3條并行的信號通路，都可以調(diào)控MITF的表達，進而影響細胞中黑色素合成[10-11]。

甘草是中國一項寶貴的中藥資源，甘草素(Liquiritigenin)是甘草中重要的黃酮類化合物之一[12]。甘草素具有抗癌、抗炎、調(diào)節(jié)血管病變、改善纖維化等多種藥理作用[13]，另外其毒副作用較小，已成為當前的研究熱點。有研究表明，甘草素可以促進B16F10中黑色素合成，但是作用機制不明確[14]。因此，本實驗在B16F10細胞上，探討甘草素調(diào)節(jié)黑色素生成的作用及分子機制，有助于闡明甘草素誘導(dǎo)黑色素合成的作用機制，為治療色素沉著障礙提供新的途徑。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高糖DMEM(11054001)、胰酶(15090046)、胎牛血清(12483020)購自美國 Gibco 公司；WB/IP 裂解液(P0013)、BCA 蛋白定量試劑盒(P0011)、ECL 發(fā)光液(P0018FS)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG(A0208)和山羊抗鼠 IgG (A0216)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗 MITF 抗體(ab20663)、兔抗 TYR 抗體(ab180753)、鼠抗 β-actin 抗體(ab179467)購自英國 Abcam 公司；鼠抗 p-ERK抗體(sc-81492)、鼠抗 ERK 抗體(sc-514302)、鼠抗 p-p38抗體(sc-166182)、鼠抗 p38抗體(sc-398546)、鼠抗 p-JNK抗體(sc-6254)、鼠抗 JNK抗體(sc-7345)購自美國Santa Cruz公司；MTT試劑盒(BB-4201)購自上海貝博生物科技有限公司；Masson-Fontana黑色素胺銀染色試劑盒(BP-DL371)購自南京森貝伽生物科技有限公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱購自日本 Sanyo 公司；多功能酶標儀購自美國 BioTek公司；化學(xué)發(fā)光成像儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

B16F10細胞在恒溫培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)進行培養(yǎng)，當細胞生長至80%左右時進行傳代，傳代至3代以后，細胞生長穩(wěn)定，進行給藥實驗。將細胞分為對照組、不同劑量甘草素處理組(10，20，40，60，80 μmol/L)，給藥處理48 h后，進行后續(xù)檢測。為了進一步探究甘草素影響黑色素合成的具體分子機制，選取40 μmol/L甘草素，處理時間分別為0，5，15，30，60，120 min。

1.3 MTT法測定細胞活力

在B16F10細胞處于對數(shù)生長期時，將細胞消化后種于96孔板中，每孔接種200 μL的細胞懸液(含10% 的FBS)，接種的細胞濃度為1×105個/mL，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)，靜置培養(yǎng)24 h。觀察細胞貼壁后進行給藥處理，吸出孔中上層液體，將含有不同濃度甘草素(0，10，20，40，60，80 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基(含2.5% 的FBS)換入96孔板中，每個濃度做4個復(fù)孔，每孔加入200 μL，然后繼續(xù)靜置培養(yǎng)48 h。 按照V(DMEM)∶V(MTT)= 10∶1的比例，提前配制DMEM培養(yǎng)基與MTT的混合溶液，避光，然后吸出孔中上層液體，每孔加入110 μL的混合溶液，放入37 ℃的培養(yǎng)箱中，孵育4 h。輕輕吸出上層液體，每孔加入150 μL的DMSO，然后放在搖床振搖10 min。將96孔板放入多功能酶標儀中，570 nm波長測定每孔的吸光度值，并計算細胞相對抑制率[15]。

1.4 NaOH裂解法測定黑色素含量

在B16F10細胞處于對數(shù)生長期時，將細胞消化后種于6孔板中，每孔接種2 mL的細胞懸液，接種的細胞濃度為1×105個/mL，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)，靜置培養(yǎng)24 h。觀察細胞貼壁后進行給藥處理，吸出孔中上層液體，將含有不同濃度待測藥物的DMEM培養(yǎng)基(含2.5% 的FBS)換入6孔板中，每孔加入2 mL，繼續(xù)靜置培養(yǎng)48 h。然后取出6孔板，用PBS洗2遍，冰上裂解20 min，刮下細胞，4 ℃離心15 min，吸凈上清蛋白，將下層的黑色素沉淀留在離心管中，然后向每個離心管中加入100 μL含10% DMSO 的NaOH 溶液，吹打混勻，然后放入80 ℃的金屬浴中，裂解2 h，取出渦旋混勻。將黑色素溶解液加入96孔板中，每孔加入100 μL，每個樣品做3個復(fù)孔，然后將96孔板放入多功能酶標儀中，設(shè)置波長405 nm，測定每孔的吸光度值[16]。

1.5 Masson-Fontana黑色素胺銀染色

選擇10%甲醛水溶液作為固定液，將細胞提前接種到玻片上給藥處理，將做好的細胞爬片放入蒸餾水中，取出爬片加入Fontana 氨銀溶液，避光浸染12 h。蒸餾水沖洗5次，入海波溶液處理切片5 min，蒸餾水處理5 min，加入中性紅染色液，輕輕復(fù)染5 min，蒸餾水沖洗，選取95%乙醇、無水乙醇脫水，最后用中性樹膠封固，進行拍照觀察[17]。

1.6 Western blot 檢測黑色素相關(guān)蛋白表達

將給藥處理的細胞使用細胞裂解液裂解，收集上層的細胞蛋白，使用BCA測定細胞蛋白濃度，繪制的濃度-吸光度標準曲線來計算樣品蛋白的濃度。每組樣品取40 μg蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，按照雙層濾紙-膜-膠-雙層濾紙的順序組裝濾紙凝膠纖維素夾層，進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后進行封閉，加入稀釋的一抗進行過夜孵育，回收一抗，用TBST清洗5次，孵育二抗，用TBST清洗5次，進行顯影。將顯影所得的條帶通過 Image J 軟件進行灰度值分析，計算相對蛋白表達量[18]。本組實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究的數(shù)據(jù)均使用 GraphPad Prism 軟件進行統(tǒng)計處理，并且采用 SPSS對實驗結(jié)果進行檢驗，P<0.05 表明數(shù)據(jù)間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(所有實驗結(jié)果均來自3次重復(fù)實驗的數(shù)據(jù))。

2 結(jié) 果

2.1 甘草素對B16F10細胞活力的影響

通過MTT法檢測不同濃度的甘草素(0，10，20，40，60，80 μmol/L)對B16F10細胞是否具有細胞毒性。由圖1可見，與空白對照組相比，甘草素的濃度為10， 20，40，60 μmol/L時，細胞活力沒有明顯受到影響，當甘草素濃度為80 μmol/L時，細胞的活力顯著下降，細胞的生長受到抑制。

圖1 甘草素對B16F10細胞活力的影響Fig.1 Effects of liquiritigenin on the viability of B16F10 cells

2.2 甘草素對B16F10細胞黑色素合成的影響

為研究甘草素對B16F10細胞黑色素合成的影響，選取對數(shù)生長期的B16F10細胞，加入同體積含不同濃度甘草素(0，10，20，40 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基(含2.5% FBS)，靜置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)48 h，NaOH裂解法測定不同濃度的甘草素(0，10，20，40 μmol/L)對B16F10細胞黑色素合成的影響。由圖2可見，給藥48 h后，與空白組對照，給藥組的黑色素含量提高，說明甘草素對黑色素合成起促進作用，隨著給藥濃度的增大，影響黑色素合成越顯著，呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖2 NaOH裂解法測定不同濃度甘草素對黑色素合成的影響Fig.2 Effect of different concentrations of liquiritigenin on melanin synthesis by NaOH pyrolysis method

通過Masson-Fontana黑色素胺銀染色方法觀察B16F10細胞的黑色素合成情況。由圖3可見，隨著甘草素濃度的增加，B16F10細胞中黑色素變多，與此同時，黑色素細胞樹突中的黑色素含量也明顯增多。

圖3 Masson-Fontana胺銀染色法測定不同濃度甘草素對黑色素合成的影響Fig.3 Effect of different concentrations of liquiritigenin on the synthesis of melanin by masson-fontana amine silver staining

2.3 甘草素對B16F10細胞中黑色素合成相關(guān)蛋白TYR，TRP-1，TRP-2表達的影響

為了研究甘草素促進黑色素合成的具體作用機制，采用免疫印跡法檢測甘草素對黑色素合成相關(guān)蛋白的影響。由圖4可見，不同濃度甘草素(0，10，20，40 μmol/L)處理B16F10細胞，酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白(TRP-1)表達顯著提高，酪氨酸酶相關(guān)蛋白(TRP-2)表達沒有提高。另外，甘草素也能促進MITF的表達。這些結(jié)果表明甘草素是通過上調(diào)黑色素合成相關(guān)蛋白TYR，TRP-1和MITF的表達，進而促進黑色素合成。

圖4 不同濃度甘草素對TYR，TRP-1，TRP-2， MITF蛋白水平的影響Fig.4 Effects of different concentrations of liquiritigenin on TYR, TRP-1, TRP-2 and MITF protein levels

2.4 甘草素對B16F10細胞中MAPK信號通路的影響

細胞中存在3條并行的MAPK通路，分別為p38，ERK和JNK。上述3條信號通路在調(diào)控黑色素合成方面都發(fā)揮重要作用。為了進一步闡明甘草素促進黑色素合成的具體分子機制。選取40 μmol/L 甘草素，用不同時間(0，5，15，30，60，120 min)來處理細胞，觀察p38，ERK和JNK的激活情況。由圖5可見，甘草素可以激活p38通路，但是對ERK和JNK信號通路沒有影響。

2.5 p38通路抑制劑對甘草素促進黑色素合成作用的影響

為了進一步證實p38通路對甘草素促進黑色素合成作用的影響，在甘草素給藥之前，細胞用10 μmol/L SB203580(p38信號通路抑制劑)預(yù)處理1 h，之后加入甘草素處理細胞48 h，檢測黑色素含量。由圖6(柱1表示空白對照，柱2表示給予SB203580，柱3表示給予甘草素，柱4表示給予SB203580+甘草素)可見，p38信號通路抑制劑SB203580顯著抑制了甘草素的促黑色素合成作用。說明甘草素通過激活p38信號通路進而促進黑色素的合成。

圖6 甘草素對MAPK通路蛋白活性的影響Fig.6 Effect of liquiritigenin on MAPK pathway protein activity

3 結(jié) 論

本實驗選取甘草素作為藥物，研究甘草素促進黑色素合成的作用及分子機制。研究結(jié)果表明：在細胞中加入不同濃度甘草素，細胞中黑色素含量明顯增多，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。Western-blot結(jié)果表明甘草素顯著促進黑色素合成關(guān)鍵蛋白TYR的表達，MITF是促進TYR表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果表明甘草素也可以顯著促進MITF的表達。MITF的表達與其上游MAPK信號通路激活存在一定關(guān)聯(lián)，細胞中主要存在3條并行的MAPK通路，分別為p38，ERK和JNK。研究表明p38的激活可以上調(diào)MITF的表達，ERK的激活則可以促進MITF的降解，JNK通路對MITF的影響依然存在爭議[19-20]。對給予甘草素處理之后細胞中的MAPK通路的激活情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)甘草素只激活p38通路，對ERK和JNK通路沒有影響。在甘草素給藥之前，用SB203580(p38通路抑制劑)預(yù)處理細胞1 h，發(fā)現(xiàn)可以抑制甘草素的促黑色素合成作用。以上研究結(jié)果表明：甘草素通過激活p38信號通路，促進TYR，TRP-1和MITF的表達，進而促進黑色素合成。黑色素對于人體有著不可或缺的重要作用，它不僅可以預(yù)防紫外線并且還調(diào)節(jié)表皮內(nèi)環(huán)境，因此，此發(fā)現(xiàn)可能為保護人類免受紫外線引起的皮膚損傷提供一個潛在的候選化合物。