全懸浮ST_HN-XF細胞的純凈性及核型分析

林鷙 趙本進 何錫忠 朱永軍 彭麗英

摘? 要：為了建立全懸浮STHN-XF種子細胞庫，本研究將馴化成功的全懸浮STHN-XF細胞連續(xù)傳代至F36代，通過純凈性和核型分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)1、F5、F16、F26、F36代的STHN-XF細胞均無菌、無支原體、無外源病毒，細胞染色體數(shù)目均為19對，即38條，結(jié)果表明各代STHN-XF細胞都是純凈的，且核型相同。

關(guān)鍵詞：STHN-XF細胞;無菌檢驗;支原體檢驗;外源病毒檢驗;核型分析

基金項目：上海市農(nóng)業(yè)委員會重點項目[滬農(nóng)科攻字（2015）第1-7號];上海市農(nóng)業(yè)科學院助推項目（ZT2018009）

作者簡介：林鷙（1987— ），男，博士，助理研究員，主要從事豬偽狂犬病相關(guān)疫畝及致病機理研究;E-mail：linzhiplain@163.com

#共同第一作者

*通信作者：彭麗英（1968— ），推廣研究員，主要從事獸用疫苗研究;E-mail：pengliying2010@ aliyun.com

懸浮培養(yǎng)細胞在國際上發(fā)展較快，已趨向成熟，是生物制品生產(chǎn)中應(yīng)用較普遍的一種生產(chǎn)工藝模式。與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細胞相比，該工藝具有操作簡單、省時、成本低等優(yōu)點。根據(jù)前期對豬偽狂犬病病毒株的細胞適應(yīng)性的研究結(jié)果，用豬源傳代細胞系——豬睪丸細胞（swine testis cell，ST細胞）繁殖豬偽狂犬病病毒株來制備疫苗效果最佳。本文對ST細胞進行懸浮培養(yǎng)馴化、傳代，并對全懸浮STHN-XF細胞的F1、F5、F26、F36代進行純凈性和核型分析。

1? 試驗材料

1.1 全懸浮STHN-XF細胞

全懸浮STHN-XF細胞為上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所課題組自行馴化和傳代的懸浮細胞株。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)細胞用的VirusPro ST-S細胞無血清培養(yǎng)基購自上海源培生物科技股份有限公司。無菌檢驗用的硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基均購自中海生物技術(shù)有限公司。支原體檢驗用的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基均購自中海生物技術(shù)有限公司。

1.3 熒光抗體檢測試劑盒

牛病毒性腹瀉病毒、豬圓環(huán)病毒2型及豬瘟病毒的間接熒光檢測試劑盒購自中海生物技術(shù)有限公司。

1.4 細胞核型分析試劑

秋水仙堿、0.075 M氯化鉀溶液、Carnoy固定液[V（甲醇）∶V（冰醋酸）=3∶1]，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 其他

其他化學試劑、液氮罐、低溫冰箱、? ?37 ℃的CO2培養(yǎng)箱、25 ℃的CO2培養(yǎng)箱、搖床、生物反應(yīng)器及其他儀器設(shè)備由上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供。

2? 試驗方法

2.1 細胞傳代

將懸浮馴化好的STHN-XF細胞37 ℃懸浮培養(yǎng)48 h，細胞密度達到3×106個/mL以上進行傳代，連續(xù)傳代至F36代，其中將F7～F16代細胞作為生產(chǎn)細胞進行凍存。細胞凍存液成分為：新生牛血清20%、二甲基亞砜（DMSO）10%、最低必需（MEM）培養(yǎng)基70%。凍存程序為4 ℃ 30 min，-20 ℃? 1 h，-70 ℃ 8 h（或過夜），將F0和F1代作為原始細胞于液氮中保存。

2.2 樣本準備

分別隨機取F1、F5、F16、F26、F36代細胞各3瓶，將同一代細胞充分混合、培養(yǎng)后，將其作為待檢樣本分別進行無菌、支原體及外源病毒檢驗。

2.3 純凈性檢驗

無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗均按現(xiàn)行2015《中華人民共和國獸藥典》進行[1]。

2.3.1 無菌檢驗

分別將0.2 mL F1、F5、F16、F26、F36代細胞的待檢樣本移植到2支硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基管中，1支置37 ℃培養(yǎng)，1支置25 ℃培養(yǎng);另分別取0.2 mL各代細胞移植到1支胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管，置25 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，觀察硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的顏色是否變黃或變渾濁。

2.3.2 支原體檢驗

分別將5 mL F1、F5、F16、F26、F36代細胞的待檢樣本移植到裝有20 mL液體培養(yǎng)基的小瓶中，搖勻后從中取0.4 mL移植到含1.8 mL培養(yǎng)基的2支小管中，每支0.2 mL，將小管和小瓶置37 ℃培養(yǎng)，分別于移植后? 5 d、10 d、15 d從小瓶中取0.2 mL培養(yǎng)物到小管中，每日觀察培養(yǎng)物顏色有無變黃或變紅。如果無變化，在最后一次移植到小管中培養(yǎng)14 d后停止觀察。如果發(fā)現(xiàn)小瓶或任何一支小管培養(yǎng)物顏色出現(xiàn)明顯變化，應(yīng)立即將小瓶中的培養(yǎng)物移植到小管液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中，觀察液體培養(yǎng)基是否出現(xiàn)恒定的pH變化，及固體培養(yǎng)基上有無典型的“煎蛋”狀支原體菌落。

2.3.3 外源病毒檢驗

分別將1 mL F1、F5、F26、F36代細胞的待檢樣本移植到3瓶單層Vero細胞和ST細胞（總面積不少于100 cm2），培養(yǎng)7 d，連傳2代，用吉姆薩染色液對單層細胞進行常規(guī)染色，觀察是否出現(xiàn)包涵體、巨細胞或其他外源病毒所致的細胞病變。

接種各代次細胞時加入適量0.2%豚鼠紅細胞和雞紅細胞的等體積混合液，分別在? ? 2 ℃～8 ℃和20 ℃～25 ℃條件下觀察紅細胞吸附現(xiàn)象。

按照間接熒光檢測試劑盒說明書，檢驗各代次細胞是否感染牛病毒性腹瀉病毒、豬圓環(huán)病毒2型及豬瘟病毒。

2.4 細胞核型分析

2.4.1 收獲細胞

取分裂旺盛期的F1、F5、F26、F36代的STHN-XF細胞，用新鮮的培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2×106個/mL～4×106個/mL，加入秋水仙堿，使其質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL，置? ?37 ℃培養(yǎng)箱中處理2 h～3 h，即可收獲細胞。

2.4.2 低滲處理

取出用秋水仙堿處理后的細胞，用吸管輕輕吹打混勻，移入10 mL離心管中，? ? ? ? 1 200 r/min離心10 min，去掉上清液，加入10 mL 0.075 M氯化鉀溶液，用吸管輕輕吹打混勻，置37 ℃培養(yǎng)箱中低滲處理30 min。

2.4.3 預固定

取出離心管，加入Carnoy固定液1 mL，用吸管輕輕吹打混勻，1 200 r/min離心10 min。

2.4.4 固定

取出離心管，去掉上清液。沿管壁緩慢加入Carnoy固定液1 mL，用吸管輕輕吹打混勻，室溫固定30 min，1 200 r/min離心? ? ? 10 min。連續(xù)固定3次。

2.4.5 制片

取出離心管，去掉上清液。用少量新鮮的固定液制成細胞懸液，常規(guī)法制片;70 ℃烤片2 h～3 h;標本片用0.25%吉姆薩染色液染色10 min。

2.4.6 核型分析

F1、F5、F26、F36代的STHN-XF細胞在顯微鏡下計數(shù)分析30～50個中期分裂相。

3? 結(jié)果

3.1 細胞庫的建立

將STHN-XF細胞連續(xù)傳代至F36代，其中F0～F16代細胞每代凍存50管于液氮中，F(xiàn)26和F36代各凍存10管于液氮中。每管上標記細胞名稱、凍存代次及時間。

3.2 無菌檢驗結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1、F5、F16、F26、F36代細胞不管是在37 ℃，還是在25 ℃下培養(yǎng)7 d，硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基的顏色均未變黃和變渾濁;在25 ℃下培養(yǎng)7 d，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的顏色也未變黃或變渾濁。結(jié)果表明，各代次細胞均無細菌感染。結(jié)果見表1。

3.3 支原體檢驗結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對照液體培養(yǎng)基的顏色沒有變化，移植到固體培養(yǎng)基后沒有出現(xiàn)典型的“煎蛋”狀菌落;陽性對照液體培養(yǎng)基的顏色變黃，在每次移植到固體培養(yǎng)基后的第7天出現(xiàn)典型的“煎蛋”狀菌落;F1、F5、F16、F26、F36代細胞移植到液體培養(yǎng)基后顏色均沒有變化，移植到固體培養(yǎng)基后均未出現(xiàn)典型的“煎蛋”狀菌落。結(jié)果表明，各代次細胞均無支原體感染。結(jié)果見表2。

3.4 外源病毒的檢驗結(jié)果

3.4.1 致細胞病變檢驗結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對照未出現(xiàn)包涵體、巨細胞或其他外源病毒所致的細胞病變，陽性對照出現(xiàn)了典型的細胞病變，F(xiàn)1、F5、F16、F26、F36代細胞均未出現(xiàn)細胞病變。結(jié)果表明各代次細胞均未感染外源病毒。

3.4.2 紅細胞吸附檢驗結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不管在2 ℃～8 ℃，還是? 20 ℃～25 ℃條件下，各代次細胞均未發(fā)現(xiàn)有紅細胞吸附現(xiàn)象，結(jié)果見表3。

3.4.3 熒光抗體檢測結(jié)果

對F1、F5、F26、F36代細胞進行牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型的免疫熒光抗體檢測后，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)熒光，表明各代次細胞均未感染上述3種病毒。結(jié)果見表4。

3.5 核型分析

對F1、F5、F26、F36代細胞的染色體進行計數(shù)發(fā)現(xiàn)，各代細胞的染色體數(shù)目均為38條。詳見圖1。

4? 結(jié)論

F1、F5、F16、F26、F36代的懸浮STHN-XF細胞經(jīng)無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗發(fā)現(xiàn)，各代次的STHN-XF細胞均無菌，無支原體，無外源病毒，表明各代次STHN-XF細胞都是純凈的。

通過對STHN-XF細胞的F1、F5、F26、F36代核型分析，結(jié)果表明細胞染色體數(shù)目均為19對，即38條，且核型相同。

懸浮培養(yǎng)指的是非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)，細胞懸浮于培養(yǎng)基中生長或維持。懸浮培養(yǎng)可以降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，便于擴大生產(chǎn)規(guī)模[2]。國內(nèi)生物制品行業(yè)應(yīng)快速實現(xiàn)行業(yè)升級，早日實現(xiàn)新技術(shù)的引進、消化和吸收，并進一步創(chuàng)新，早日與國際接軌，提高我國生物制品行業(yè)在國際上的競爭力[3]。

參考文獻

[1] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（2015版）[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2016.

[2] 劉鑫瑩，李建華，李睿.ST單細胞懸浮生長的馴化及培養(yǎng)工藝優(yōu)化[J].農(nóng)家參謀，2018（19）：233.

[3] 陳文慶，王建超，劉華杰.懸浮培養(yǎng)工藝與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的比較分析[J].中國獸藥雜志，2010，44（10）：37-41.