蛋白酶的研究歷史、發(fā)現(xiàn)及在健康和疾病中的作用(續(xù)1)

范美紅譯 王晶晶審

摘? 要：《生物化學(xué)雜志》（Journal of Biological Chemistry，JBC）一直是傳播和記錄蛋白酶發(fā)現(xiàn)和特性的主要載體。1971-2010年，在Herb Tabor博士擔(dān)任JBC主編期間，蛋白酶領(lǐng)域的研究取得了快速的發(fā)展。當(dāng)他開始任職時，只有少數(shù)蛋白酶的精細(xì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)為人所知?，F(xiàn)在，人們已對數(shù)千種蛋白酶進(jìn)行了鑒定，在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了600多個蛋白酶基因。本綜述除了回顧Herb Tabor博士對JBC以及美國生物化學(xué)和分子生物學(xué)學(xué)會（American society for biochemistry and molecular biology，ASBMB）在蛋白酶研究中所起的可貴貢獻(xiàn)外，筆者還盡力概述了蛋白酶領(lǐng)域的研究歷史，重點介紹了在蛋白酶研究過程中的一些發(fā)現(xiàn)及其在動物體內(nèi)的作用。此外，本綜述還討論了金屬蛋白酶，特別是龍蝦肽酶家族中穿膜肽酶（meprin）的結(jié)構(gòu)特征、調(diào)控、作用機(jī)制以及在動物健康和疾病中的作用。蛋白酶和蛋白質(zhì)降解作用在生命系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，筆者還簡要介紹了這一高度多樣化和蓬勃發(fā)展的研究領(lǐng)域的未來方向。

關(guān)鍵詞：蛋白酶;金屬蛋白酶;研究歷史;作用機(jī)制;結(jié)構(gòu)特征;生理功能

3? 金屬蛋白酶特性和生理功能的研究進(jìn)展

金屬蛋白酶已經(jīng)成為一組引人關(guān)注的酶。它們存在于所有生物界中，并在進(jìn)化過程中廣泛擴(kuò)展。1980年，研究人員共鑒定出11種金屬蛋白酶。目前，已知小鼠和人類的基因組編碼了大約200種金屬蛋白酶，是蛋白酶領(lǐng)域中最大的一組酶。這些酶中大多數(shù)由細(xì)胞分泌或與質(zhì)膜相結(jié)合，在細(xì)胞周圍和細(xì)胞外發(fā)揮作用。在胚胎發(fā)育過程中，它們參與組織的分化和重塑，在成年組織中參與加工具有生物活性的肽和細(xì)胞因子。用于控制血壓的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑是人類使用最廣泛的抑制劑之一。金屬蛋白酶還與許多疾病有關(guān)，如癌癥和炎癥性疾病。它們和其抑制劑（如金屬蛋白酶組織抑制劑）具有很大的醫(yī)學(xué)價值，臨床試驗結(jié)果既讓人樂觀，又讓人失望。利用金屬蛋白酶的合成抑制劑來抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移為人類戰(zhàn)勝癌癥展現(xiàn)了巨大的希望，但尚未發(fā)揮其潛力。

鋅金屬蛋白酶超家族包含大多數(shù)已知的金屬內(nèi)切蛋白酶（在蛋白質(zhì)底物內(nèi)部裂解肽鍵的含鋅酶）。該超家族由六個相關(guān)的進(jìn)化家族組成：解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinases，ADAMs）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、妊娠相關(guān)血漿蛋白酶、沙雷菌蛋白酶、利什曼原蟲表面蛋白酶（leishmanolysins）和龍蝦肽酶。這些酶家族中的每一個家族都有多個單獨(dú)的酶，并且在發(fā)現(xiàn)和生理功能上都有極具吸引力的故事。有趣的是，不同家族的蛋白酶結(jié)構(gòu)域在氨基酸序列上具有相對較低的相似度。然而，所有的催化結(jié)構(gòu)域都具有驚人相似的三維結(jié)構(gòu)，活性位點有一個保守的鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域[HEXHXX（G/N）XX（H/D）]以及一個保守的甲硫氨酸轉(zhuǎn)角（Met-turn）。下面將重點討論龍蝦肽酶家族，特別是該家族的穿膜肽酶。

龍蝦肽酶家族是20世紀(jì)80年代和90年代進(jìn)行大量克隆和測序的結(jié)果。通過序列相似性鑒定，該家族最初的成員包括：龍蝦肽酶，來自人骨的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（bone morphogenetic protein-1，BMP-1），來自小鼠腎臟和人類腸道的穿膜肽酶，來自非洲爪蟾胚胎部分序列的UVS.2 （uterine-egg viteline envelope soluble）。之所以命名為“龍蝦肽酶家族”，是因為奧斯塔歐洲螯蝦（Astacus astacus）的龍蝦肽酶是該家族中第一個被測序和描述的酶。龍蝦肽酶存在于動物和細(xì)菌中，目前還沒有在植物和真菌中發(fā)現(xiàn)。隨著對許多物種的基因組測序，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種的龍蝦肽酶。在人類和小鼠的基因組中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了6個龍蝦肽酶家族基因，其中包括2個穿膜肽酶基因、3個骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（bone morphogenetic protein-1，BMP-1）/tolloid樣基因和1個ovastacin基因。在黑腹果蠅和秀麗隱桿線蟲中，分別發(fā)現(xiàn)了16種和40種龍蝦肽酶。在黑腹果蠅和秀麗隱桿線蟲中，大多數(shù)龍蝦肽酶基因的功能尚未確定，但在寄生線蟲中，龍蝦肽酶參與蛋白質(zhì)在細(xì)胞外基質(zhì)中的移動，在水螅中參與頭部再生。

在已描述的龍蝦肽酶中，螯蝦的龍蝦肽酶分子量最小，含有一個200個氨基酸殘基的催化結(jié)構(gòu)域。從cDNA測序中得知，在蛋白質(zhì)合成過程中有一個前原（prepro）序列被切割。到目前為止，在所有測序的龍蝦肽酶家族成員中都發(fā)現(xiàn)了前（pre）序列或信號序列，估計是為了引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和分泌途徑。原序列（pro sequence）作為一種調(diào)節(jié)機(jī)制，能使酶失去活性?；钚则r蛋白只含有一個約20 kDa的催化結(jié)構(gòu)域，而大多數(shù)龍蝦肽酶家族成員含有一個或多個非催化結(jié)構(gòu)域，位于蛋白酶結(jié)構(gòu)域的C端。許多含有一個或多個表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣結(jié)構(gòu)域，以及一個CUB（補(bǔ)體亞組分Clr/Cls、胚胎海膽蛋白UEGF、BMP-1）結(jié)構(gòu)域。這些對蛋白與蛋白或蛋白與底物之間的相互作用很重要。非催化結(jié)構(gòu)域是造成家族成員大小不一的原因，大小從200個氨基酸（小龍蝦龍蝦肽酶）到900個氨基酸（小鼠BMP-1）不等。此外，許多更復(fù)雜的龍蝦肽酶是高度糖基化的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步提高了分子質(zhì)量和復(fù)雜性。

龍蝦肽酶家族成員——穿膜肽酶是一類獨(dú)特的寡聚金屬蛋白酶，包含兩個進(jìn)化上相關(guān)的α和β亞基的同源和異源寡聚體。它們體現(xiàn)了鋅金屬蛋白酶超家族成員的復(fù)雜性。

穿膜肽酶發(fā)現(xiàn)于1980年，是在糖尿病小鼠中尋找蛋白酶的結(jié)果。在由鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病BALB/c小鼠中尋找蛋白酶活性和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)變化的過程中，使用各種底物測量了肝臟、腎臟和肌肉組織中的蛋白酶活性。與對照組小鼠相比，在糖尿病小鼠組織中測量的肝臟降解率或蛋白酶活性沒有發(fā)現(xiàn)根本變化。然而，研究發(fā)現(xiàn)，在堿性條件（pH9）下，以偶氮酪蛋白（azocasein）為底物時，這些小鼠的腎臟具有相對高的活性。然后，從BALB/c小鼠腎臟中純化了這種酶，發(fā)現(xiàn)它是一種糖基化的膜結(jié)合金屬蛋白酶，α亞基分子質(zhì)量為85 kDa～90 kDa。該亞基形成二硫鍵二聚體，二聚體形成320 kDa的四聚體。Sterchi等（1982）報道了人體中與小鼠穿膜肽酶相當(dāng)?shù)囊环N名為對氨基苯甲酸（para aminobenzoic acid，PABA）肽酶（以水解底物命名）的腸道酶，但這兩種酶之間的相似性直到它們被克隆和測序后才被發(fā)現(xiàn)。

1983年，BALB/c小鼠有一段時間無法使用，筆者實驗室從另外兩個近交系C3H/He小鼠和CBA小鼠中收集腎臟。與BALB/c小鼠相比，這些小鼠腎臟中的偶氮酪蛋白酶（azocaseinase）活性非常低。因此，Beynon（1983）撰寫了一篇闡述多種C系小鼠缺陷的論文。梅奧醫(yī)學(xué)中心的小鼠免疫遺傳學(xué)家Chella David注意到了該論文，他告訴筆者，許多C系小鼠是為移植研究培育的，在主要組織相容性復(fù)合體基因上存在差異。這些觀察結(jié)果促使相關(guān)研究人員開展合作，并發(fā)現(xiàn)小鼠17號染色體上靠近主要組織相容性復(fù)合體的一個基因（Mep-1a）能夠調(diào)控小鼠腎臟中穿膜肽酶活性的表達(dá)水平。現(xiàn)在已知，Mep-1a可編碼穿膜肽酶的α亞基。對缺陷型或穿膜肽酶低活性小鼠品系的進(jìn)一步研究顯示，它們表達(dá)的是含有β亞基的穿膜肽酶的潛伏形式。穿膜肽酶的β亞基與α亞基在催化結(jié)構(gòu)域上具有58%的相似性，并由小鼠18號染色體編碼，這是一個由單一基因分化進(jìn)化的例子。對不同品系小鼠的穿膜肽酶α亞基和β亞基的研究發(fā)現(xiàn)，穿膜肽酶α亞基與β亞基在小鼠腎臟中有幾種不同的組合，形成穿膜肽酶的四級結(jié)構(gòu)，以及穿膜肽酶的A和B異構(gòu)體，分別為EC 3.4.24.63和EC 3.4.24.18。尚不清楚造成一些近交系小鼠成年后缺乏穿膜肽酶α亞基表達(dá)的原因，但已知這受進(jìn)化的調(diào)控，因為所有小鼠品系在胚胎期和青春期前腎臟都能表達(dá)穿膜肽酶α亞基和β亞基。

20世紀(jì)80年代對穿膜肽酶的研究是利用從成年小鼠腎臟刷狀緣膜中分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行的。在偶氮酪蛋白酶活性高的小鼠體內(nèi)，穿膜肽酶含有α和β亞基，而在該酶活性低的小鼠（缺陷型品系）體內(nèi)，穿膜肽酶只含有β亞基。這種小鼠的穿膜肽酶α亞基在質(zhì)膜上是有活性的，而β亞基主要是潛伏的，但可以被類胰蛋白酶激活。對穿膜肽酶α亞基激活的研究表明，去除原序列可以形成包括兩個N端殘基的氫鍵，這對酶的結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。隨著20世紀(jì)80年代和90年代分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是克隆、測序和定向誘變等技術(shù)的發(fā)展，對穿膜肽酶α亞基結(jié)構(gòu)和功能的研究取得了快速的發(fā)展。

穿膜肽酶異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，具有多域、多聚體結(jié)構(gòu)。寡聚體由穿膜肽酶α亞基和/或β亞基的二硫鍵連接的二聚體組成，這些二聚體可能會自聯(lián)，形成分子質(zhì)量更大的異構(gòu)體。同源穿膜肽酶Α只含有α亞基，異源穿膜肽酶Α含有α亞基和β亞基，而同源穿膜肽酶B只含有β亞基。兩個亞基都是糖基化的，天冬酰胺連接糖對二硫鍵的形成、低聚反應(yīng)、穩(wěn)定性、分泌和酶活性很重要。至于結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，兩個亞基都含有一個信號序列、原序列、蛋白酶（催化）結(jié)構(gòu)域、甲基偶氮甲醇（methylazomethanol，MAM）結(jié)構(gòu)域、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF）結(jié)構(gòu)域、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C端小尾巴（6～26個氨基酸）。非催化結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍酌傅倪\(yùn)輸、結(jié)構(gòu)和活性很重要。α亞基和β亞基結(jié)構(gòu)域的一個明顯區(qū)別是，穿膜肽酶α亞基在EGF樣結(jié)構(gòu)域和TRAF結(jié)構(gòu)域之間含有一個I（插入的）結(jié)構(gòu)域，而β亞基沒有。在分泌途徑的成熟過程中，I結(jié)構(gòu)域內(nèi)有一個蛋白酶切，導(dǎo)致該亞基從膜上釋放出來。通過定點誘變將I結(jié)構(gòu)域從穿膜肽酶α亞基中移除，結(jié)果顯示I結(jié)構(gòu)域?qū)τ诘鞍踪|(zhì)水解和亞基從膜上釋放是必要和充分的。因此，只含有穿膜肽酶α亞基的穿膜肽酶異構(gòu)體被分泌到細(xì)胞外。二硫鍵連接穿膜肽酶α亞基二聚體往往會以非共價鍵結(jié)合成1 MDa～6 MDa的高分子質(zhì)量復(fù)合物，其是生物系統(tǒng)中分泌的最大的蛋白酶復(fù)合物之一。這種自聯(lián)作用使單體穿膜肽酶A集中在細(xì)胞外環(huán)境中，并且可能對穩(wěn)定性和作用很重要，特別是在感染部位和腸道的惡劣環(huán)境中。與細(xì)胞膜相關(guān)的穿膜肽酶都含有穿膜肽酶β亞基，可能由穿膜肽酶β亞基二硫鍵連接二聚體、形成四聚體的穿膜肽酶α亞基/β亞基二聚體或與穿膜肽酶α亞基二聚體非共價結(jié)合的穿膜肽酶α亞基/β亞基二聚體組成。對穿膜肽酶β亞基二聚體的交聯(lián)研究揭示了蛋白質(zhì)內(nèi)有一個域間和域內(nèi)接觸的緊湊結(jié)構(gòu)，包括TRAF-TRAF相互作用。人類穿膜肽酶B的X射線結(jié)構(gòu)顯示，活性位點靠近膜，這對該亞型的脫落活性有影響。

穿膜肽酶在腎臟和腸道刷狀緣膜上的定位最初是通過細(xì)胞分級分離研究和隨后的免疫組織化學(xué)研究推斷出來的。穿膜肽酶也在白細(xì)胞中表達(dá)，對這些細(xì)胞的研究表明，在敲除穿膜肽酶β亞基基因的小鼠中，這些細(xì)胞通過細(xì)胞外基質(zhì)的能力減弱。穿膜肽酶在單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中的表達(dá)，會影響這些細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。人類穿膜肽酶α亞基和β亞基在表皮的不同層中表達(dá)，并參與細(xì)胞增殖和人類皮膚細(xì)胞的終末分化。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺、睪丸、胎兒肝臟、胚胎干細(xì)胞和腦組織中都檢測到了穿膜肽酶亞基的mRNA，其中表達(dá)水平最高的是腎臟和腸。因此，研究人員主要在這些組織中研究穿膜肽酶的生理功能。通過構(gòu)建基因敲除小鼠，同時對小鼠進(jìn)行挑戰(zhàn)，研究已經(jīng)收集到關(guān)于穿膜肽酶生理功能的其他見解。

穿膜肽酶能夠水解各種底物，從肽到蛋白質(zhì)。小鼠穿膜肽酶B對裂解部位的酸性殘基有明顯的偏好。相比之下，同源穿膜肽酶A更喜歡裂解含有小的或疏水氨基酸殘基的鍵。這些偏好導(dǎo)致肽底物的水解作用存在明顯差異。例如，穿膜肽酶B可以裂解促胃液素和骨橋蛋白，但穿膜肽酶A不能，穿膜肽酶A可以裂解緩激肽和P物質(zhì)，但穿膜肽酶B不能。穿膜肽酶B還可以裂解細(xì)胞表面蛋白，如E-鈣黏蛋白和上皮細(xì)胞鈉通道，從而影響細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用和離子運(yùn)輸。穿膜肽酶A可裂解緊密連接蛋白——閉合蛋白，這會損害上皮屏障功能，增強(qiáng)單核細(xì)胞遷移。穿膜肽酶異構(gòu)體對細(xì)胞因子的激活和降解也有不同的偏好，穿膜肽酶異構(gòu)體的平衡可能對細(xì)胞因子譜和炎癥反應(yīng)進(jìn)程有重要影響。在尋找人類穿膜肽酶的底物時，高通量技術(shù)發(fā)現(xiàn)了許多底物以及穿膜肽酶與ADAMs之間有趣的聯(lián)系。

充分的證據(jù)表明，穿膜肽酶與一些疾病有關(guān)，這將是未來需要探索的領(lǐng)域，并有望治愈這些疾病。例如，穿膜肽酶存在于炎癥部位，會影響白細(xì)胞的遷移，降解緊密連接蛋白，并激活/降解細(xì)胞因子。利用穿膜肽酶α基因敲除小鼠進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，在腸道疾病模型中，穿膜肽酶α亞基表達(dá)減少增加了腸道的炎癥反應(yīng)。此外，人類甲基多巴α亞基基因是炎癥性腸病，特別是潰瘍性結(jié)腸炎的易感基因。穿膜肽酶還會影響小鼠尿路感染進(jìn)程。對小鼠的其他研究表明，穿膜肽酶與腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，人類甲基多巴β亞基基因的多態(tài)性與比馬印第安人的糖尿病腎病有關(guān)。穿膜肽酶在各種癌（如結(jié)腸癌和乳腺癌）細(xì)胞中都有表達(dá)，研究認(rèn)為其在腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移中起著一定的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，穿膜肽酶在體內(nèi)能裂解淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP），這意味著其在神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥的發(fā)生上起著一定的作用。最近對穿膜肽酶與腸道中黏蛋白相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，它在保護(hù)宿主上皮細(xì)胞免受細(xì)菌侵害和影響腸道菌群組成方面發(fā)揮著一定的作用。

4? 小結(jié)

未來的挑戰(zhàn)之一是了解蛋白酶在生物體內(nèi)的功能，并能在特定組織中選擇性地激活和抑制它們。蛋白酶存在于其他分子和蛋白酶的網(wǎng)絡(luò)環(huán)境中，存在于細(xì)胞間、細(xì)胞膜和細(xì)胞外環(huán)境中，這些環(huán)境無疑在測定其功能上至關(guān)重要。大系統(tǒng)理論，如結(jié)合運(yùn)用遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)來鑒定底物和活性蛋白酶的降解組學(xué)，將是了解和調(diào)控蛋白酶系統(tǒng)所必需的。Herb Tabor為JBC打下了基礎(chǔ)，研究從單種酶的鑒定和特性描述進(jìn)入了復(fù)雜的多組分系統(tǒng)，以闡明蛋白酶在生命結(jié)構(gòu)中的作用。

（續(xù)完）

原題名：Proteases： history， discovery， and roles in health and disease（英文）

原作者：Judith S. Bond1