IL-6抑制劑對種植體周圍炎小鼠模型的療效及其作用機(jī)制探討

門貝 朱燕

[摘要]目的：探討IL-6抑制劑對種植體周圍炎小鼠模型的療效及其作用機(jī)制。方法：選取4周齡雄性小鼠（C57BL/6J）15只，實驗總共分為三組（每組5只）：對照組（植入種植體，但未進(jìn)行結(jié)扎誘導(dǎo)）、模型組（結(jié)扎誘導(dǎo)，構(gòu)建種植體周圍炎小鼠模型）和抑制劑組（結(jié)扎誘導(dǎo)+腹腔注射IL-6抑制劑）。使用微計算機(jī)斷層掃描（Micro-CT）檢測種植體周圍骨丟失，蘇木精和伊紅（HE）染色檢測種植體周圍牙齦組織的炎癥浸潤，使用RT-qPCR檢測牙齦組織中白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α） mRNA相對表達(dá)量，使用Western blot法檢測牙齦組織中NF-κB通路相關(guān)蛋白p-P65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：Micro-CT結(jié)果顯示IL-6抑制劑可減少種植體周圍炎的骨喪失。HE結(jié)果顯示IL-6抑制劑處理后，小鼠炎癥浸潤顯著減少。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，IL-6抑制劑可顯著降低牙齦組織中IL-6、TNF-α mRNA相對表達(dá)量以及p-P65和p-IκBα的蛋白表達(dá)水平。結(jié)論：IL-6抑制劑可抑制種植體周圍炎的骨喪失和炎癥浸潤，這些治療效果可能與抑制TNF-α的表達(dá)和NF-κB信號通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]IL-6抑制劑;種植體周圍炎;小鼠模型;TNF-α;NF-κB通路;骨流失

[中圖分類號]R782.12? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）05-0090-04

Curative Effect and Mechanism of IL-6 Inhibitor on Mice with Peri-implantitis

MEN Bei1，ZHU Yan2

（1.Department of Prosthodontics and Implant，Dazhong Stomatological Hospital，Wuhan 430000，Hubei，China;2.Department of Prosthodontics and Implant，Hubei Provincial People's Hospital，Wuhan 430060，Hubei，China）

Abstract： Objective? To investigate the curative effect and mechanism of IL-6 inhibitor on mice with peri-implantitis. Methods? Fifteen 4-week-old male mice （C57BL/6J） were selected， and the experiment was divided into 3 groups （5 mice in each group： the control group （implants implanted， but no ligation induction）， the model group （ligation induction： construction peri-implantitis mouse model） and the inhibitor group （ligation induction + intraperitoneal injection of IL-6 inhibitor）. Microcomputed tomography （Micro-CT） was used to detect peri-implant bone loss. Hematoxylin and eosin （HE） staining was used to detect inflammatory infiltration in peri-implant gingival tissue. The mRNA relative expression levels of interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in gingival tissue were detected by RT-qPCR. The protein expression levels of NF-κB pathway related proteins p-P65 and p-IκBα in gingival tissue were detected by Western blot. Results? Micro-CT results showed that IL-6 inhibitor could reduce bone loss in peri-implant inflammation. HE results showed that inflammatory infiltration in mice was significantly reduced after IL-6 inhibitor treatment. RT-qPCR and Western blot results showed that IL-6 inhibitor significantly decreased the mRNA relative expression levels of IL-6 and TNF-α， and the protein expression levels of p-P65 and p-IκBα in gingival tissue. Conclusion? IL-6 inhibitors can inhibit bone loss and inflammatory infiltration in peri-implantitis， and these therapeutic effects may be related to the inhibition of TNF-α expression and NF-κB signaling pathway.

Key words： IL-6 inhibitor; peri-implantitis; mice model; TNF-α; NF-κB pathway; bone loss

近年來，種植義齒由于其高度可預(yù)測性和高成功率被廣泛應(yīng)用于無牙牙合或牙列缺損患者的恢復(fù)[1]，然而據(jù)報道，仍然有30%的患者由于牙科植入物引起種植體周圍炎（Peri-implantitis）[2]，種植體周圍炎是種植體周圍組織發(fā)生炎癥，可導(dǎo)致骨喪失[3-5]，因此了解種植體周圍炎的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)IL-6在種植體周圍炎中扮演著重要的作用，研究報道IL-6在種植體周圍炎患者中高表達(dá)[6]，且抑制IL-6的表達(dá)可顯著抑制種植體周圍炎的發(fā)展[7]。然而IL-6在種植體周圍炎中的作用機(jī)制還不完全明確，本研究將通過構(gòu)建種植體周圍炎小鼠模型，探討IL-6抑制劑對種植體周圍炎小鼠模型的療效，并深入探究其作用機(jī)制，爭取為臨床上治療種植體周圍炎提供新的理論參考依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：IL-6抑制劑（北京百奧萊博科技有限公司，貨號為：M07110）;鈦種植體（四川大學(xué)國家生物材料工程研究中心，中國成都）;甲醛（Thermo Fisher）;蘇木精染色液（上海紫一試劑廠）;伊紅染色液（上海古朵生物科技有限公司）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）;RT-qPCR試劑盒[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司];IL-6、TNF-α和β-actin引物（上海吉瑪制藥有限公司）;p-P65（Abcam）;p-IκBα（上海鈺博生物科技有限公司）;β-actin（Abcam）;二抗（北京博爾西科技有限公司）;顯微計算機(jī)斷層掃描儀（Skyscan， Kontich， Belgium）;顯微鏡（MV2100，蘇州卡吉德化學(xué)科技有限公司）。

1.2 實驗動物：4周齡雄性小鼠（C57BL/6J）15只，體重為18～22 g，購自華中科技大學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號為：SCXK（鄂）2021—0009。實驗前馴化1周。在實驗期間，小鼠隨機(jī)喂食軟性飼料。

1.3 種植體周圍炎的誘導(dǎo)：所有小鼠吸入3%的異氟醚進(jìn)行麻醉，然后拔除左側(cè)上頜第一、二、三臼齒，拔牙部位愈合8周后，將表面光滑的螺旋形狀鈦種植體植入上頜左第二磨牙區(qū)域，每只小鼠1顆，然后去除牙齦瓣并鉆孔截骨，種植體植入牙槽骨深度約1 mm。種植體愈合4周后，在種植體根尖處和頭部，分別用絲線扎入種植體，誘導(dǎo)種植體周圍炎。正常對照組種植體未進(jìn)行結(jié)扎。

1.4 給藥和實驗分組：15只小鼠，實驗總共分為3組（每組5只）：對照組（植入種植體，但未進(jìn)行結(jié)扎誘導(dǎo)）、模型組（結(jié)扎誘導(dǎo)）和抑制劑組（結(jié)扎誘導(dǎo)+腹腔注射IL-6抑制劑）。種植體周圍炎小鼠模型構(gòu)建成功后，腹腔注射5 mg/kg的IL-6抑制劑，每4周注射1次，總共注射3次，最后一次給藥2 d后處死小鼠并檢測相應(yīng)指標(biāo)，其中對照組和模型組給予相同劑量的生理鹽水。

1.5 Micro-CT實驗：將小鼠處死后，取各組小鼠上頜骨，切除皮膚以及肌肉后，在顯微鏡下收集腭側(cè)牙齦組織，用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，使種植體的頭部和軸在矢狀面和冠狀面彼此垂直，然后在各向同性體素分辨率下進(jìn)行檢測。之后導(dǎo)入Dolphin軟件，生成圖像。然后采用三維形態(tài)分析并計算種植體周圍骨丟失量[8]。

1.6 蘇木精和伊紅（HE）染色實驗：取牙齦組織使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，放入包埋盒中，用流水沖洗固定液，然后使用不同濃度的酒精進(jìn)行脫水，用二甲苯進(jìn)行透明，并將已透明的組織放入石蠟中進(jìn)行包埋，之后對包埋好的組織進(jìn)行切片（5 μm）。然后進(jìn)行染色，將切片用蘇木精水溶液進(jìn)行染色，蒸餾水沖洗后使用酒精進(jìn)行脫水，在用伊紅染色液進(jìn)行染色3 min，脫水封片后在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.7 反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）實驗：分離各組牙齦組織，加入裂解液進(jìn)行勻漿，并使用試劑盒提取總RNA，檢測提取的RNA濃度和質(zhì)量后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒把RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)。IL-6引物序列為：F：5’-GCTGGAGTCACAGAAGGAGTGGC-3’;R：5’-GGCATAAC GCACTAGGTTTGCCG-3’。TNF-α引物序列為：F：5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGG-3’;R：5’-TATCTCTCAGCTCCACGCCATT-3’。β-actin引物序列為：F：5’-GAGCGCGGCTACAGCTT-3’;R：5’-TCCTTAATGTCACGCACGCACGATTT-3’。

1.8 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗：收集各組小鼠牙齦組織，提取總蛋白，并使用BCA法測定蛋白濃度，將變性后的蛋白溶液進(jìn)行上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后使用脫脂牛奶（5%）室溫封閉1 h后，分別加入p-P65（1：500）、p-IκBα（1：400）和β-actin（1：5 000）一抗，然后4℃條件下培養(yǎng)過夜，加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記）（1：5 000），室溫條件下培養(yǎng)1 h后ECL進(jìn)行顯影，并進(jìn)行分析和檢測灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析：使用SPSS 26.0對所用數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，并用Graphpad prism 8.0作圖，兩組間比較使用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 三組種植體周圍骨質(zhì)流失情況：各組種植體存活率均為100%，由圖1A可知，與對照組相比，模型組的骨尖水平較高，而與模型組相比，抑制劑組的骨尖水平較低。由圖1B可知，與對照組相比，模型組的種植體周圍的骨質(zhì)流失體積顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;而與模型組相比，抑制劑組的骨質(zhì)流失體積顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 三組牙齦組織炎癥浸潤情況：由圖2可知，對照組有輕度浸潤，與對照組比較，模型組牙齦炎癥嚴(yán)重浸潤;而與模型組相比，抑制劑組牙齦浸潤程度明顯減輕。

2.3 三組牙齦組織中IL-6 mRNA表達(dá)：由圖3可知，與對照組相比，模型組的IL-6 mRNA顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，抑制劑組的IL-6 mRNA相對表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 三組牙齦組織中TNF-αmRNA的表達(dá)：由圖4可知，與對照組相比，模型組的TNF-αmRNA相對表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，抑制劑組的TNF-αmRNA相對表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。表明IL-6抑制劑可顯著抑制種植體周圍炎小鼠牙齦組織中TNF-α的表達(dá)。

2.5 三組牙齦組織中NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)：由圖5可知，與對照組相比，模型組的p-P65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;而與模型組相比，抑制劑組的p-P65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。表明IL-6抑制劑可能通過抑制NF-κB通路抑制促炎因子的釋放。

3? 討論

近年來，隨著人們生活水平的提高，越來越多的人選擇種植義齒來修復(fù)失牙，然而隨著種植體在人群中應(yīng)用的增加，種植體所引起的相關(guān)疾病也在逐漸增加，包括種植體周圍黏膜炎和種植體周圍炎[9]。據(jù)研究報道，有將近45%的種植體部位和近55%的種植體患者表現(xiàn)為種植體周圍炎，種植體周圍炎的主要表現(xiàn)為種植體周圍組織損傷，具體為種植體周圍牙槽骨破壞以及炎癥反應(yīng)[10-11]。種植體周圍炎的發(fā)展是由多種因素造成的，其中白介素和腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子在種植體周圍炎的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，白介素-6（IL-6）是一種炎癥因子[12]，多個研究已經(jīng)報道IL-6可促進(jìn)種植體周圍炎的進(jìn)展[6，13]。IL-6抑制劑的使用已被證實在多種疾病中具有顯著抗炎作用[14-15]。余科等研究發(fā)現(xiàn)IL-6抑制劑可顯著減輕兔體內(nèi)種植體炎癥性骨吸收，并增加周圍骨體積率[16]。然而IL-6抑制劑在種植體周圍炎中的作用機(jī)制還不清楚，本研究通過構(gòu)建種植體周圍炎小鼠模型發(fā)現(xiàn)IL-6抑制劑可顯著抑制種植體周圍炎導(dǎo)致的周圍組織骨流失并抑制牙齦組織中IL-6的表達(dá)，且HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-6抑制劑處理后可顯著抑制種植體周圍組織的炎性浸潤，這與余科等的研究結(jié)果一致。

腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種細(xì)胞因子，主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞分泌，參與調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)。近年來，有學(xué)者認(rèn)為TNF-α在種植體周圍炎中也具有重要的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-6抑制劑處理種植體周圍炎模型小鼠后，可顯著抑制牙齦組織中TNF-αmRNA的表達(dá)，這表明IL-6抑制劑可通過抑制種植體周圍組織骨流失以及抑制TNF-α的表達(dá)減輕種植體周圍炎。

NF-κB通路是一種經(jīng)典的炎癥反應(yīng)相關(guān)的重要信號通路，在NF-κB通路被激活時，P65和IκBα發(fā)生磷酸化，NF-κB信號通路參與調(diào)控各個階段的炎癥反應(yīng)，并被證實可調(diào)控包括TNF-α在內(nèi)的許多炎癥細(xì)胞因子。前人已經(jīng)證實NF-κB通路在牙周炎的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用[18-19]。本研究中發(fā)現(xiàn)，IL-6抑制劑可顯著抑制種植體周圍炎小鼠牙齦組織中p-P65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平，這表明，IL-6抑制劑可抑制NF-κB信號通路P65和IκBα蛋白的磷酸化水平。

綜上，IL-6抑制劑可通過抑制牙齦組織骨流失以及抑制促炎因子TNF-α的釋放減輕小鼠種植體周圍炎，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。

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[收稿日期]2021-08-17

本文引用格式：門貝，朱燕.IL-6抑制劑對種植體周圍炎小鼠模型的療效及其作用機(jī)制探討[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2022，31（5）：90-93.