亞砷酸鈉對人肝星狀細(xì)胞活化的影響及機(jī)制

李昂，黃菲，迪麗娜爾·亞爾麥麥提，丁關(guān)鑫，日沙來提·塔依爾，吳順華

1 新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，烏魯木齊 830011；

2 新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室

砷是一種廣泛存在于水、土壤等環(huán)境介質(zhì)中的有毒類金屬。無機(jī)砷（iAs）是Ⅰ類致癌物。除職業(yè)暴露外，長期飲用高濃度iAs 污染的地下水是人體高砷暴露的主要途徑［1］。iAs 可對人和動物均產(chǎn)生毒害作用，長期接觸iAs 會導(dǎo)致皮膚損傷、神經(jīng)損傷、糖尿病、血液循環(huán)系統(tǒng)病變、肝損傷和癌癥等多種疾?。?-3］。肝臟是砷代謝的主要靶器官。長期接觸iAs 可使肝纖維化、肝硬化，最終導(dǎo)致肝臟發(fā)生癌變。肝纖維化是可逆的病理過程，抑制肝星狀細(xì)胞活化是治療肝纖維化以及預(yù)防肝癌發(fā)生的有效策略。iAs 誘發(fā)肝癌的機(jī)制與氧化應(yīng)激、DNA 和染色體損傷、凋亡、壞死、甲基化等有關(guān)。然而，其確切致癌機(jī)制尚不明了。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬在砷致癌的機(jī)制中起重要作用。自噬是一種通過降解蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，獲得維持生存所必需營養(yǎng)物質(zhì)，參與物質(zhì)能量循環(huán)的過程［4］。iAs 暴露可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，但其機(jī)制尚未完全闡明。自噬是肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制［5］。因此，調(diào)節(jié)自噬或可成為治療肝臟疾病的新方向之一。在正常肝組織中星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，不表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）。2021 年8月—2022 年3 月，本研究以人肝星狀細(xì)胞（LX-2 細(xì)胞）為研究對象，探討亞砷酸鈉（NaAsO2）對LX-2 細(xì)胞自噬的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 LX-2 細(xì)胞（中國武漢普諾賽生命科技有限公司），具有短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定報(bào)告。NaAsO2（中國北京化學(xué)試劑三廠），胎牛血清、DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），Western Breeze 化學(xué)發(fā)光蛋白印跡檢測試劑盒、RIPA 裂解液、4×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（中國北京索萊寶科技有限公司），α-SMA、蛋白激酶B（AKT）、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1（Hes1）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、GAPDH 抗體（英國Abcam 公司）。超凈工作臺（中國江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司）、凝膠成像分析系統(tǒng)、Western blotting 電泳裝置及轉(zhuǎn)膜裝置（美國Bio-Rad 公司）、酶聯(lián)免疫檢測儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清、雙抗的高糖培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞隔2 天換1 次液，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時，用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，依照1∶2 進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收集生長狀況良好且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 NaAsO2實(shí)驗(yàn)染毒濃度篩選 采用MTT 法。取對數(shù)生長期LX-2 細(xì)胞，用胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min（離心半徑13.5cm），棄上清液，加入5 mL完全培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液用完全培養(yǎng)基稀釋（5×104個/mL），將100 μL 細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔細(xì)胞密度5×104個/mL，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后，棄上清液，依次在各個實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)加入濃度為0、5、15、20、30、40、50 μmol/L的NaAsO2培養(yǎng)液（每孔10 μL），同時設(shè)定空白組（無細(xì)胞，只有培養(yǎng)基）、對照（正常細(xì)胞加完全培養(yǎng)基）；置于培養(yǎng)箱內(nèi)作用48 h后，除空白組外，向每孔中加入稀釋的MTT 溶液（每孔10 μL），培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后取出，1 500 r/min 離心10 min（離心半徑13.5 cm），吸去上清后除空白孔外每孔加入150 μL DMSO，用錫箔紙包裹后置于搖床上孵育10 min，放入酶標(biāo)儀中，振蕩3 min，測定波長490 nm處OD 值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/對照組OD 值）×100%。通過細(xì)胞增殖抑制率和染砷濃度計(jì)算細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）。根據(jù)IC50篩選NaAsO2實(shí)驗(yàn)濃度。

1.4 細(xì)胞自噬變化觀察 采用透射電子顯微鏡。將細(xì)胞隨機(jī)分為四組，對照組及NaAsO2低、中、高濃度組，分別用0、5、10、15 μmol/L的NaAsO2干預(yù)48 h，取各組細(xì)胞用胰酶消化后收集細(xì)胞，PBS溶液漂洗3遍，去掉PBS 溶液，加入0.5 mL 戊二醛，轉(zhuǎn)移到

1.5 mL離心管中。2 000 r/min離心5 min（離心半徑13.5 cm），4 ℃冰箱保存。經(jīng)包埋、超薄切片（厚度70 nm）、電子染色電鏡（×40 000）下觀察，調(diào)整放大倍數(shù)確定視野內(nèi)出現(xiàn)自噬小體。

1.5 細(xì)胞活化蛋白（α-SMA）及自噬蛋白（AKT、Hes1、mTOR）表達(dá)檢測 采用Western blotting 法。干預(yù)48 h，取各組細(xì)胞，用裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯法測定蛋白濃度，取相同質(zhì)量的蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE 轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，用Western Breeze 試劑盒中的封閉液室溫封閉30 min，α-SMA一抗（稀釋比例1∶5 000）、AKT一抗（稀釋比例1∶10 000、Hes1一抗（稀釋比例1∶1 000）、mTOR一抗（稀釋比例1∶10 000）、內(nèi)參GAPDH（稀釋比例1∶10 000），4 ℃搖床孵育過夜，抗體洗液漂洗3 次，二抗室溫孵育30 min，抗體洗液漂洗3 次，堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯影。用Image Lab 軟件讀取顯影各條帶的灰度值，目的蛋白的表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NaAsO2染毒濃度篩選結(jié)果 經(jīng)5、15、20、30、40、50 μmol/L 的NaAsO2處理48 h，LX-2 細(xì)胞OD 值分別為1.29±0.06、0.75±0.09、0.93±0.10、0.61±0.02、0.57±0.06、0.47±0.07，細(xì)胞增殖抑制率分別為8.13%、46.14%、33.90%、56.66%、58.82%、66.52%。對照細(xì)胞OD 值為1.45±0.01。隨著Na-AsO2染毒濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高（P＜0.05）。IC50為26.46 μmol/L，以IC50及細(xì)胞活性為參照選擇5、10、15 μmol/L為實(shí)驗(yàn)所需濃度。

2.2 NaAsO2對LX-2細(xì)胞自噬的影響 對照組可觀察到自噬小體、自噬溶酶體。與對照組相比，NaAsO2低、中、高濃度組細(xì)胞間隙逐漸增寬，觀察到“假狄氏間隙”，自噬小體數(shù)量增加，脂滴的分布更加密集?？梢姴糠志€粒體腫脹、空泡化，大量線粒體嵴斷裂，NaAsO2高濃度組以上變化最為明顯。

2.3 NaAsO2對LX-2 細(xì)胞活化的影響 對照組及NaAsO2低、中、高濃度組α-SMA 蛋白相對表達(dá)量分別為0.13 ± 0.02、0.23 ± 0.04、0.32 ± 0.06、0.48 ±0.10。與對照組比較，NaAsO2低、中、高濃度組α-SMA蛋白相對表達(dá)量逐漸升高（P均＜0.05）。

2.4 Na2AsO2對LX-2 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，NaAsO2低、中、高濃度組AKT、mTOR 蛋白表達(dá)逐漸降低，Hes1蛋白表達(dá)逐漸升高（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞AKT、mTOR、Hes1蛋白表達(dá)比較（xˉ± s）

3 討論

肝臟是砷代謝的主要靶器官［6］。iAs 攝入人體后，隨著血液分配到肝臟，在肝細(xì)胞中不斷積累，與巰基結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而影響細(xì)胞代謝。肝纖維化是慢性肝損傷后傷口持續(xù)愈合的可逆的病理過程。在肝纖維化過程中，處于靜態(tài)的肝星狀細(xì)胞不斷被激活，并促進(jìn)活化標(biāo)志蛋白α-SMA 的表達(dá)，從而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加，改變肝臟組織結(jié)構(gòu)［7］。本研究中，NaAsO2處理LX-2 細(xì)胞48 h，隨著染毒濃度的增加α-SMA 表達(dá)逐漸升高?？梢奛aAsO2可促進(jìn)人肝星狀細(xì)胞活化。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬參與肝纖維化形成的過程［5］。細(xì)胞自噬是吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或受損細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，借此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和受損細(xì)胞器的更新的過程［8］。研究表明，當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)或受到某種刺激時，自噬通過溶酶體降解細(xì)胞質(zhì)成分，使細(xì)胞在營養(yǎng)耗竭時維持能量穩(wěn)態(tài)［9］。因此，在本研究中，NaAsO2染毒LX-2 細(xì)胞48 h，通過透射電鏡觀察到圓形雙層膜包裹著被降解的各種物質(zhì)的小體即自噬小體，證明了NaAsO2干預(yù)下LX-2 細(xì)胞發(fā)生自噬。研究表明，肝炎、肝脂肪變性、纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌等多種肝臟疾病可能以依賴于自噬的方式發(fā)生發(fā)展［10］。其中，肝纖維化作為可逆的病理階段與自噬密切相關(guān)。研究認(rèn)為，人肝星狀細(xì)胞含有大量脂滴，細(xì)胞自噬可能促進(jìn)脂滴分解成游離脂肪酸，為細(xì)胞外基質(zhì)的激活和分泌提供了大量能量，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化［11］。研究發(fā)現(xiàn)，卡維地洛通過抑制自噬和促進(jìn)LX-2細(xì)胞凋亡來減輕肝纖維化［12］。因此，自噬水平升高是肝細(xì)胞活化和肝纖維化的促進(jìn)劑，減少自噬抑制肝細(xì)胞活化可能是治療的靶點(diǎn)。本研究觀察不同濃度NaAsO2處理LX-2 細(xì)胞后，自噬相關(guān)蛋白AKT、mTOR、Hes1表達(dá)的變化。

AKT 在細(xì)胞存活、增殖、分化、代謝和重組細(xì)胞骨架等多種細(xì)胞生命過程中起重要作用［13］。研究表明，AKT與自噬的發(fā)生密切相關(guān)。AKT被PI3K 活化后磷酸化，隨之活化下游因子mTOR。mTOR是調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成的關(guān)鍵細(xì)胞營養(yǎng)傳感器［14］，是調(diào)節(jié)自噬過程的主要因子。研究發(fā)現(xiàn)，奧曲肽通過抑制AKT/mTOR 通路，激活自噬并減輕脂多糖誘導(dǎo)的人肺上皮細(xì)胞損傷［15］。iAs 可通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路誘導(dǎo)自噬發(fā)生，使小鼠海馬錐體神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)元軸突變性，細(xì)胞萎縮［16］。因此AKT/mTOR 通路與自噬密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，隨著NaAsO2濃度的增高，AKT 和mTOR 蛋白表達(dá)顯著降低。mTOR 是AKT 的重要下游信號節(jié)點(diǎn)，其高度保守，使?fàn)I養(yǎng)、生長因子、應(yīng)激等多種細(xì)胞外信號一起整合，參與細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞周期、生物代謝、自噬等眾多生物過程。PI3K/AKT 信號通路作為一個成熟的mTOR 上游調(diào)節(jié)器，可通過激活mTOR 抑制自噬。研究表明，外泌體通過抑制mTOR，上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞的自噬水平，減緩炎癥作用，修復(fù)急性腎損傷［17］。在骨肉瘤中，iAs通過抑制AKT/mTOR 和激活ROS/JNK 信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬［18］。因此，AKT/mTOR 對于自噬具有負(fù)調(diào)控作用。本研究結(jié)果提示，NaAsO2可能通過抑制AKT/mTOR激活來誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞自噬。

Hes1 屬于前神經(jīng)元堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族成員，在胚胎發(fā)育中影響細(xì)胞的增殖和分化［19］。研究表明，microRNA-30e通過Notch1/HES1/AKT信號通路調(diào)控自噬，從而保護(hù)心臟免受缺血和再灌注損傷［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NaAsO2中、高濃度組Hes1 表達(dá)均顯著升高。因此，隨著NaAsO2濃度的升高Hes1 表達(dá)上調(diào)并可能影響AKT/mTOR 通路的調(diào)控。

綜上所述，NaAsO2誘導(dǎo)LX-2活化與自噬密切相關(guān)，且隨著NaAsO2濃度的升高作用增強(qiáng)。