VAV1是動脈粥樣硬化預(yù)后的潛在靶點和生物標志物

謝思安，徐俊玄，寧婷婷，張 楠，朱圣韜，劉 思

(首都醫(yī)科大學(xué)北京友誼醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 100050)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種血管壁的慢性炎性反應(yīng)性疾病，以動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展為特征，導(dǎo)致動脈腔的硬化和狹窄[1]。動脈粥樣硬化是許多心血管疾病的基礎(chǔ)，包括心肌梗死、外周動脈疾病和冠狀動脈疾病，是全球首要死亡原因[2]。識別預(yù)后標志物和潛在藥物靶點以提高預(yù)后和個體化治療的互為必要。

鳥嘌呤核苷酸交換因子1(vav guanine nucleotide exchange factor 1，VAV1)是一種核苷酸交換因子，調(diào)節(jié)細胞骨架排列、細胞運動和細胞黏附的功能。VAV1最初被認為是一種致癌基因，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)控作用[3]。隨著研究的深入，VAV1被發(fā)現(xiàn)是一種重要的信號傳導(dǎo)分子，在細胞生長和分化的過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用[4]。研究表明VAV1在調(diào)控泡沫細胞功能過程中起重要作用。研究表明VAV1/RAC1通路影響巨噬細胞骨架和細胞遷移，抑制此通路可減少斑塊形成，促進巨噬細胞向淋巴結(jié)遷移，抑制巨噬細胞來源的泡沫細胞的遷移能力[5]。然而其在血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)中的作用還尚未有研究。

本研究通過基因表達匯編(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫中獲得的3組AS測序數(shù)據(jù)集中篩選出VAV1在動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展過程中表達顯著上升；通過體外VSMCs培養(yǎng)及功能實驗來探究VAV1對VSMCs收縮功能和增殖能力的調(diào)控，為動脈粥樣硬化的早期診斷及治療提供一個潛在的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料:F-12培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；平滑肌細胞生長因子(Cell Application公司)；青鏈霉素混合液(北京華中海威基因科技公司)；小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)(蘇州吉瑪生物科技有限公司)； 蛋白分子質(zhì)量標志物、BCA蛋白定量試劑盒、Trizol(Thermo Fisher Scientific公司)；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、OPTI-MEM培養(yǎng)基、重組核糖核酸酶抑制劑、Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠 IgG、Alexa Fluor 555標記的山羊抗兔IgG(Invitrogen公司)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP Mix(Promega公司); 引物(上海生工生物工程股份有限公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)公司)；蛋白酶抑制劑(Roche 公司)；2 X SYBR Mix、5X蛋白質(zhì)上樣緩沖液(北京康潤誠業(yè)生物科技公司)；脫脂奶粉(BD公司)；抗GAPDH抗體、抗SMMHC抗體、抗SM22α抗體、抗VAV1抗體(Proteintech公司)；鼠尾 Ⅰ 型膠原溶液(Corning公司)；增強化學(xué)發(fā)光體系 (BIO-RAD公司)；EdU檢測試劑盒(CellLight公司)；高脂飼料(Research Diet公司)。

1.1.2 細胞及實驗動物:人臍動脈平滑肌細胞(human umbilical artery smooth muscle cells，HUSMCs)購自上海中喬新舟生物有限公司。C57/BL6小鼠(WT型)和ApoE-/-小鼠(C57/BL6背景)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析方法

1.2.1 AS樣本測序數(shù)據(jù)獲取及差異表達基因篩選:由GEO數(shù)據(jù)庫中獲得3組AS樣本測序數(shù)據(jù)集，包括GSE57691、GSE28829和GSE43292。GSE57691包含10個正常對照主動脈血管和9個主動脈硬化閉塞癥血管組織樣本。GSE28829包含13個早期動脈粥樣硬化和16個進展期動脈粥樣硬化斑塊樣本，GSE43292包含32個對應(yīng)的斑塊周旁頸動脈和32個來自動脈內(nèi)膜切除術(shù)取出的頸動脈斑塊組織。使用GEO2R分析工具篩選3組數(shù)據(jù)集中的差異表達基因(different expression genes, DEGs)后，通過Jvenn分析網(wǎng)站(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)進行取交集并繪圖，獲得3組數(shù)據(jù)集中均有表達顯著變化的DEGs，其中|logFC|>1及P<0.05被認定具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.2 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks)構(gòu)建與Hub基因篩選:使用STRING網(wǎng)站(https://www.string-db.org/)篩選基因間交互評分≥0.6的DEGs，去除沒有基因交互作用的基因后，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。進一步通過Cytoscape軟件構(gòu)建并可視化分析PPI網(wǎng)絡(luò)并通過基因中心性篩選Hub基因。

1.2.3VAV1鑒定:毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫(comparative toxicogenomics database，CTD；https://ctdba se.org/)，用于發(fā)現(xiàn)識別化學(xué)基因、化學(xué)疾病和基因疾病的相互作用，以生成擴展的網(wǎng)絡(luò)并預(yù)測新的關(guān)聯(lián)。通過CTD數(shù)據(jù)庫對VAV1進行鑒定，獲取VAV1參與人類疾病過程的相關(guān)性數(shù)據(jù)。

1.3 生物學(xué)實驗驗證

1.3.1 細胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染:細胞在含10%胎牛血清、10%平滑肌細胞生長因子和青霉素/鏈霉素 (1 000 U/mL) 的F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。應(yīng)用于實驗的細胞應(yīng)在細胞解凍后傳代至少2代。當細胞匯合度為70%左右時，使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑和100 nmol/L siRNA，敲低VAV1的表達。siRNA序列如下:siRNA-VAV1:5′-GAGCUGUUCUUCAAGAC AA-3′，siNC:5′-UUGUCUUGAAGAACAGCUC-3′。

1.3.2 蛋白免疫印跡分析:使用RIPA裂解液收集并裂解細胞后，使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。調(diào)勻各樣本蛋白濃度后，將等量的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使用5%脫脂牛奶封閉。經(jīng)VAV1、SMMHC、SM22α或GAPDH抗體孵育過夜后，同種屬第二酶標抗體室溫下孵育1 h。使用增強化學(xué)發(fā)光體系進行免疫印跡分析。

1.3.3 實時熒光定量PCR實驗:Trizol裂解細胞后按說明書提取總RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR儀進行RNA定量檢測。VAV1引物正向序列：5′-CAACCTGCGTGAGGTC AAC-3′，反向序列：5′-ACCTTGCCAAAATCCTGCA CA-3′；SMMHC引物正向序列：5′-CGCCAAGAGAC TCGTCTGG-3′，反向序列：5′-TCTTTCCCAACCGT GACCTTC-3′；SM22α引物正向序列：5′-AGTGCAG TCCAAAATCGAGAAG-3′，反向序列：5′-CTTGCTC AGAATCACGCCAT-3′；GAPDH引物正向序列：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAA-3′，反向序列：5′-GGCT GTTGTCATACTTCTCATGG-3′。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-△△Ct方法計算VAV1、SMMHC、SM22α的相對RNA表達量。

1.3.4 膠原凝膠收縮實驗:按2.5×105個細胞/mL：Ⅰ型膠原(4.42 mg/mL)∶0.1 mol/L NaOH∶2 F-12培養(yǎng)液∶FBS=4∶5∶1∶8∶2的體積比混合，上述混合液接種于12孔板，置于37 ℃孵育1 h以聚合成膠原凝膠。加入含有2% FBS的F-12培養(yǎng)基，使用抹刀將凝膠小心地與培養(yǎng)皿壁分離后，在37 ℃孵箱中培養(yǎng)過夜。相對凝膠面積=現(xiàn)膠原凝膠面積/初始凝膠面積。

1.3.5 EdU染色:使用EdU試劑孵育細胞 2 h后，用4%多聚甲醛固定；用2 mg/mL甘氨酸溶液和0.5% Triton X-100溶液分別處理后， Apollo染色反應(yīng)液避光孵育30 min；用1 ×Hoechst 33342反應(yīng)液對細胞核進行染色。使用熒光顯微鏡觀察細胞熒光，計算Apollo/Hoechst陽性率。

1.3.6 動物實驗:動物實驗經(jīng)北京大學(xué)倫理委員會批準健康科學(xué)中心(LA2015017)。8周齡雄性WT(wild type)型及ApoE-/-小鼠給予致動脈粥樣硬化的高脂飼料喂養(yǎng)8周。實驗結(jié)束后，用4%多聚甲醛組織固定液保存主動脈根部和主動脈弓動脈，制備石蠟切片用以免疫熒光染色。

1.3.7 免疫熒光染色:切片置于室溫2 h自然曬干后，使用PBS緩沖液中進行水化。5%封閉液室溫封閉 1 h后，置于1∶200～1∶000的稀釋比例稀釋一抗的封閉液中孵育過夜。根據(jù)一抗物種的來源加入用封閉液稀釋好的熒光二抗室溫避光封閉 1 h。使用含有 DAPI的封劑染色 5 min后，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 動脈粥樣硬化斑塊基因表達譜數(shù)據(jù)

本研究共納入3個AS數(shù)據(jù)集。GSE57691中獲得4 406個DEGs，上調(diào)基因828個，下調(diào)基因3 578個；GSE28829中獲得1 265個DEGs，上調(diào)基因780個，下調(diào)基因485個；GSE43292共獲得945個DEGs，上調(diào)基因551個，下調(diào)基因394個(圖1A～C)。

A-C.volcano plots and histogram of DEGs in GSE57691，GSE28829 and GSE43292; the X axis indicated the fold-change (logscale) and the Y axis showed the P value (logscale); each symbol represented a different gene; P<0.05, log|fold-change| ≥1

2.2 Hub基因篩選與VAV1鑒定

66個上調(diào)基因和86個下調(diào)基因在3個數(shù)據(jù)集中均發(fā)生表達變化(圖2A)。上述152個DEGs篩選前10個Hub基因分別為VAV1、CD4、ITGAX、CXCL8、ITGAL、IL10RA、TAGAP、NCF4、LCP2、FLNC(圖2B)。CTD數(shù)據(jù)庫顯示VAV1靶向動脈粥樣硬化及其他心血管疾病(圖2C)。

2.3 VAV1在動脈粥樣硬化斑塊中的表達分析

VAV1在GSE57691、GSE28829和GSE43292數(shù)據(jù)集的AS斑塊中均有顯著上調(diào)(圖3A)。免疫熒光染色的結(jié)果顯示：與WT小鼠相比，VAV1在ApoE-/-小鼠的血管組織表達升高(圖3C)。VSMCs標志物SMMHC與VAV1的表達有顯著共定位，這提示VSMCs是高表達VAV1的主要細胞(圖3B)。

2.4 VAV1抑制血管平滑肌細胞收縮功能

為了進一步證實VAV1在VSMCs中的作用，使用本特異性siRNA降低VSMCs中VAV1的表達水平(圖4A,B)。結(jié)果表明，敲低VAV1后收縮表型標志蛋白SMMHC和SM22α的表達顯著增加(P<0.05)(圖4A,B)。通過膠原凝膠收縮實驗和EdU染色實驗評估VSMCs的收縮能力和增殖能力，結(jié)果證實VAV1能夠抑制VSMCs的收縮功能，促進其增殖(圖4C,D)。

3 討論

盡管對AS的認識和治療取得了重大進展，但其病因尚未完全闡明，其臨床并發(fā)癥如心肌梗死、腦卒中和周圍血管疾病仍然是全球范圍內(nèi)死亡的主要原因[2,6]。隨著測序通量的顯著提高和成本的降低，生物信息學(xué)分析已被廣泛用于探索和識別某些疾病的臨床顯著生物標志物和潛在靶點。本研究在GEO數(shù)據(jù)庫中獲取3組動脈粥樣硬化組織測序的數(shù)據(jù)集，以尋找動脈粥樣硬化的潛在生物標志物。根據(jù)生物信息學(xué)分析可知，在AS斑塊中表達顯著變化的基因152個。利用DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)探尋與動脈粥樣硬化進展過程中的Hub基因。VAV1作為Hub基因與動脈粥樣硬化等心血管疾病進程顯著相關(guān)，這就提示該指標可作為一個AS的潛在治療靶點。

A.differentially expressed genes (DEGs) among GSE57691，GSE28829 and GSE43292; B.top ten highly connected genes (Hub genes) of the protein-protein interaction(PPI) network; C.relationship to progression of atherosclerosis related to VAV1 based on the CTD database

A.expression levels of VAV1 in atherosclerosis and normal tissue samples among GSE57691，GSE28829 and GSE43292; B.double immunostaining for SMMHC (smooth muscle cells-marker, green) and VAV1 (red) in WT and apoE-/- mice to identify the major cells for VAV1 secretion; C.relative fluorescence intensity data for VAV1 in WT and apoE-/- mice to identify the VAV1 expression difference(n=6); *P<0.05, **P<0.01 compred with control or WT

A,B.protein and mRNA expression of VAV1, SMMHC and SM22α in smooth muscle cells with transfected VAV1 siRNA; C.representative gel contraction images and the quantification of gel contraction with transfected VAV1 siRNA; D.representative image of EdU incorporation and quantification of EdU-positive cells treated by VAV1 knockdown(scale bar=200 μm); *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with siNC group

通過免疫熒光染色實驗可知，VAV1在動脈粥樣硬化斑塊中表達顯著增加。研究表明，VAV1與CD36介導(dǎo)的巨噬細胞轉(zhuǎn)化的泡沫細胞形成有關(guān)，其通過cJUN信號通路調(diào)控動脈粥樣硬化斑塊的形成[7]。此外另一篇研究也證實VAV1/RAC1通路影響調(diào)節(jié)T細胞的細胞骨架和細胞遷移，抑制VAV1可減少AS斑塊形成，T細胞促進巨噬細胞向淋巴結(jié)遷移，抑制巨噬細胞來源的泡沫細胞的遷移能力[5]。此外研究表明VAV1與SMMHC陽性的細胞有共定位，這提示VAV1主要在血管平滑肌中高表達，然而VAV1在血管平滑肌細胞中的作用還未明確。

VSMCs是血管的重要組成細胞，在正常生理狀態(tài)下，其主要維持血管的收縮功能[8]然而血管平滑肌細胞具有高度可塑性，當在病理進展過程中能夠由收縮表型向多種非收縮表型間轉(zhuǎn)換[9-10]。進一步通過檢測收縮蛋白SMMHC和SM22α的表達以及凝膠收縮實驗證實，抑制VAV1的表達能夠提升VSMCs的收縮能力；EdU染色實驗也證實VAV1能夠促進VSMCs增殖能力。研究報道證實VAV1是一種信號傳導(dǎo)分子，在細胞生長和分化的調(diào)控過程中起關(guān)鍵作用，其高表達可以使細胞進入細胞周期，促進細胞增殖[4,11-12]，這與本研究的結(jié)果一致。這提示VAV1促進VSMCs異常增殖很可能是其促進AS進展的重要調(diào)控通路。

本研究分析發(fā)現(xiàn)VAV1是動脈粥樣硬化進展過程中重要的調(diào)控分子，可能通過抑制VSMCs收縮功能并導(dǎo)致其異常增殖有關(guān)，為進一步研究VAV1在AS中的作用機制提供新的線索。