小鼠乳腺癌肺特異性轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系的建立和驗(yàn)證

王子轅，段昭君，羅云萍

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 免疫學(xué)系， 北京 100005)

乳腺癌(breast cancer)是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，高居全球女性癌病死率的首位[1]。乳腺癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因，90%的乳腺癌患者死亡可以歸因于腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2][3]。乳腺癌常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移器官包括骨、肺、肝、腦和淋巴結(jié)等，其中肺臟被認(rèn)為是乳腺癌轉(zhuǎn)移的第二大常見(jiàn)部位[4-5]。肺轉(zhuǎn)移乳腺癌患者治療后的中位生存期為22個(gè)月，5年總生存率僅為16.8%[6]。肺轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響了乳腺癌患者的預(yù)后。

乳腺癌轉(zhuǎn)移模型是探究轉(zhuǎn)移嗜器官性分子機(jī)制的重要研究工具。其按照建立方法可分為自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型和實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型[7]。現(xiàn)階段的乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型的親本細(xì)胞來(lái)源主要集中于高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系。人源乳腺癌異種移植方面， MDA-MB-231細(xì)胞系通過(guò)尾靜脈注射的方法建立了實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型[8]。鼠源乳腺癌同種移植方面，目前已建立了4T1-luc和4T1的原位肺轉(zhuǎn)移模型[9-10]，但4T1屬于高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，本身就存在著一定程度的肺轉(zhuǎn)移，篩選的過(guò)程只是將原有的肺轉(zhuǎn)移特性放大，因此這些模型均無(wú)法很好反應(yīng)轉(zhuǎn)移器官微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。4T07是一株低轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞系，它有能力離開(kāi)原發(fā)部位卻不易形成明顯的轉(zhuǎn)移灶[11]。熒光素酶(luciferase)常用于腫瘤研究中的生物發(fā)光成像，當(dāng)與底物結(jié)合時(shí)可以使轉(zhuǎn)染luciferase的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)出生物光，通過(guò)高靈敏度的光探測(cè)器進(jìn)行成像后可以觀察到腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)分布，是探究腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的常用成像方式[12]。所以研究采用4T07作為親本細(xì)胞構(gòu)建乳腺癌肺特異性轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系4T07LuM，并且通過(guò)轉(zhuǎn)染篩選穩(wěn)定表達(dá)luciferase的4T07-luc和4T07LuM-luc細(xì)胞來(lái)驗(yàn)證體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力，以期為研究乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移機(jī)制提供合適的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞系： SPF級(jí)6周雌性的Balb/c小鼠(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T07(美國(guó)斯克里普斯研究所Ralph A.Reisfeld實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))。該動(dòng)物研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院倫理審查委員會(huì)審查和批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑：RPMI 1640(Biological Industries公司)；0.25% Trypsin、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液和Opti-MEM(Gibco公司)；Ⅳ型膠原蛋白酶(Thermo Fisher Scientific公司)；VivoGloTMLuciferin和D-luciferin(Promega公司)；蘇木精染料和伊紅染料(ZSGB-BIO公司)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；Polybrene 助感染試劑(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：4T07/4T07LuM細(xì)胞系/亞系在含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為37 ℃，氣體環(huán)境為5% CO2/95%空氣，濕度為飽和。對(duì)于細(xì)胞傳代，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞，并以1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型的篩選：將處于對(duì)數(shù)增殖期的小鼠乳腺癌細(xì)胞4T07用0.25% EDTA的胰蛋白酶消化，制成5×106個(gè)細(xì)胞/mL單細(xì)胞懸液。每只Balb/c小鼠經(jīng)尾靜脈注射100 μL。2～3周后在無(wú)菌條件下對(duì)小鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理。使用Ⅳ型膠原蛋白酶消化肺臟腫瘤轉(zhuǎn)移灶，并通過(guò)70 μm濾膜研磨過(guò)濾腫瘤組織，得到細(xì)胞懸浮液。將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后讓細(xì)胞貼壁，并更換新鮮的完全培養(yǎng)基。體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，將富集培養(yǎng)的細(xì)胞再次注射到小鼠尾靜脈，重復(fù)上述篩選過(guò)程3輪，得到細(xì)胞亞系4T07lung-S3。

1.2.3 自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型的篩選：將100 μL 5×106個(gè)細(xì)胞/mL的4T07lung-S3細(xì)胞懸液接種到Balb/c小鼠的第4對(duì)乳腺脂肪墊中，35 d后對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，消化肺轉(zhuǎn)移的細(xì)胞并進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)。之后將富集培養(yǎng)的細(xì)胞接種到小鼠的第4對(duì)乳腺脂肪墊中，并再次重復(fù)自發(fā)轉(zhuǎn)移篩選兩輪，得到細(xì)胞亞系4T07LuM。

1.2.4 Luciferase細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建：為了實(shí)時(shí)觀察體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況，本研究構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)luciferase的細(xì)胞系/亞系4T07和4T07LuM，并分別標(biāo)記為4T07-luc、4T07LuM-luc。轉(zhuǎn)染前1 d將293T細(xì)胞鋪入6孔板內(nèi)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將luciferase表達(dá)質(zhì)粒和pLP1、pLP2和pLP/VSVG慢病毒穿梭質(zhì)粒和輔助包裝原件載體質(zhì)粒按照分子質(zhì)量計(jì)算DNA用量，總計(jì)2 μg DNA。將2 μg DNA稀釋于100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻后靜置5 min，同時(shí)將2 μL Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑置于100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻后靜置5 min。將Lipofectamine2000稀釋液逐滴加入DNA稀釋液中，混勻后靜置20 min。再將200 μL轉(zhuǎn)染工作液加入培養(yǎng)液中混勻后置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，4～6 h后換液。48 h后收取上清病毒，6孔板感染4T07/4T07-LuM細(xì)胞，在不含雙抗的完全培養(yǎng)基中，每孔加入1 mL病毒原液并添加2 μg/mL的助感染試劑polybrene，6 h后換液。感染病毒后的細(xì)胞增殖匯合達(dá)到80%時(shí)，更換為新鮮的含嘌呤霉素的培養(yǎng)基處理細(xì)胞。直至未感染的空白對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后，更換完全培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.5 小動(dòng)物活體成像檢測(cè)體內(nèi)轉(zhuǎn)移情況：使用PBS配制150 mg/mL的D-luciferin儲(chǔ)存液(10×工作液)，-80 ℃保存。實(shí)驗(yàn)前，使用PBS稀釋D-luci-ferin儲(chǔ)存液至1×工作液。將荷瘤小鼠放置于麻醉箱通入異氟烷麻醉。腹腔注射D-luciferin工作液(10 μL/g)，10 min后將小鼠放置于活體成像箱中進(jìn)行成像拍照，并且記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 石蠟包埋切片及蘇木精和伊紅染色檢測(cè)肺轉(zhuǎn)移灶：為了進(jìn)一步探究luciferase熒光信號(hào)是否意味有腫瘤灶或病變的存在，將原位接種4T07-luc和4T07LuM-luc細(xì)胞的小鼠的肺組織切片進(jìn)行了HE染色。將安樂(lè)死的小鼠手術(shù)取出肺組織后，立即放入4%多聚甲醛溶液中固定2 d。流水漂洗組織塊后，使用梯度濃度的乙醇溶液脫水組織，然后使用二甲苯進(jìn)行透明處理，浸蠟后將組織整理包埋于石蠟塊中。對(duì)包埋材料進(jìn)行修整后，固定在切片機(jī)上，4 μm組織切片，將切片于溫水中展片，并用載玻片從一側(cè)撈片后放置于60℃的烤片機(jī)上烤干。

將石蠟包埋的切片浸入梯度濃度的乙醇中進(jìn)行脫蠟處理。復(fù)水后，依次用蘇木精染色，用鹽酸乙醇進(jìn)行分化，用氨水漂洗返藍(lán)，脫水后再用0.5%伊紅乙醇溶液復(fù)染。在每張載玻片上滴一滴中性樹(shù)脂，并覆蓋蓋玻片。制好的玻片在顯微鏡下觀察，對(duì)核質(zhì)深染的區(qū)域進(jìn)行拍照統(tǒng)計(jì)。

1.2.7 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法檢測(cè)體外遷移和侵襲：為了探究4T07LuM細(xì)胞體外遷移和侵襲水平變化，將4T07和4T07LuM細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞匯合至90%時(shí)，使用黃槍頭在每個(gè)孔中沿小孔直徑垂直劃線，然后給每個(gè)孔換液去除脫落的細(xì)胞，將孔中完全培養(yǎng)基換成含1% FBS的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。0、24、48 h內(nèi)鏡下觀察孔內(nèi)劃痕寬度的變化，每個(gè)孔內(nèi)選取3個(gè)獨(dú)立視野進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)劃痕愈合比例。

重懸4T07和4T07LuM細(xì)胞至1×106個(gè)/mL，在24孔小室(先鋪1%FBS的培養(yǎng)基)中加200 μL的細(xì)胞懸液。將小室懸掛于24孔板中，板孔加入500 μL的10% FBS完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 h后，將小室從細(xì)胞板中取出，PBS清洗后，多聚甲醛固定。再次用PBS清洗后，將小室浸沒(méi)于結(jié)晶紫染料中染色，染色結(jié)束后蒸餾水清洗并用棉簽擦拭，顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)遷移至小室膜外側(cè)的細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)分析免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度：為了探究小鼠體內(nèi)免疫微環(huán)境的改變，在安樂(lè)處死4T07和4T07LuM荷瘤小鼠后，使用酒精對(duì)腫瘤周?chē)M(jìn)行消毒，取出小鼠的脾臟、原位腫瘤和肺臟，脾臟直接置于基本培養(yǎng)基中研磨，70 μm濾膜過(guò)濾細(xì)胞懸液；原位腫瘤和肺臟切碎后加入5 mL Ⅳ型膠原酶工作液，搖床消化2 h，70 μm濾膜過(guò)濾細(xì)胞懸液；將上述的細(xì)胞懸液混勻離心后加入裂紅液，裂解紅細(xì)胞結(jié)束后將入完全培養(yǎng)基終止裂解，離心后重懸即得到可用于上機(jī)檢測(cè)的單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)5×105個(gè)細(xì)胞，離心后100 μL PBS重懸。向100 μL的細(xì)胞懸液中加入1 μL抗體。4 ℃避光孵育30 min，再次離心后棄去上清。然后用PBS洗滌細(xì)胞2次，500 μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)比例，采用FlowJo軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系4T07LuM的構(gòu)建流程

細(xì)胞亞系4T07LuM構(gòu)建過(guò)程經(jīng)由多輪體內(nèi)篩選(圖1A)。先經(jīng)過(guò)3輪實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移篩選，尾靜脈接種5×105個(gè)/100 μL 4T07細(xì)胞，2周后發(fā)現(xiàn)肺出現(xiàn)明顯的腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，而肝臟和脾較為正常，未發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移灶(圖1B)。將肺轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞體外富集培養(yǎng)后，得到細(xì)胞亞系4T07lung-S3。然后進(jìn)行自發(fā)性轉(zhuǎn)移篩選，小鼠腹部第4對(duì)乳腺脂肪墊原位接種4T07lung-S3細(xì)胞，35 d左右消化肺臟中的腫瘤組織，體外富集培養(yǎng)得到4T07LuM細(xì)胞。

A.flow chart of cell subline 4T07LuM construction and screening; B.tumor metastasis in lung, liver and spleen of mice 2 weeks after tail vein inoculation

2.2 4T07LuM細(xì)胞較原代細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

篩選所得的4T07LuM鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化不明顯，細(xì)胞貼壁增殖黏附排列，大小較為一致，細(xì)胞形狀呈現(xiàn)梭型和球型，細(xì)胞邊界明顯，細(xì)胞數(shù)量也沒(méi)有發(fā)生明顯變化(圖2)。

2.3 4T07LuM細(xì)胞肺特異性轉(zhuǎn)移情況

與對(duì)照組4T07-luc相比，4T07LuM-luc組小鼠發(fā)生了明顯肺轉(zhuǎn)移的情況(圖3A)。安樂(lè)處死小鼠后，分離出小鼠的各個(gè)器官檢測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，心臟和肺臟處能夠檢測(cè)出較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，肝臟中只檢測(cè)出微弱的熒光強(qiáng)度(圖3B,C)，其余器官均無(wú)法檢測(cè)出熒光信號(hào)，證實(shí)4T07LuM具有肺特異性轉(zhuǎn)移的能力。

2.4 病理檢測(cè)4T07LuM細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移灶

與活體成像結(jié)果一致，相較于4T07組， 4T07LuM組肺的HE染色結(jié)果可以觀察到正常組織細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)了異型性細(xì)胞，核質(zhì)深染，胞核體積和核質(zhì)比例增大，可觀測(cè)到雙核或多核細(xì)胞，證實(shí)為腫瘤細(xì)胞(圖4)。

圖2 顯微鏡下4T07LuM細(xì)胞形態(tài)Fig 2 4T07LuM microscopy-based cell morphology

A.tumor lung metastasis 35 days after in situ vaccination for breast cancer; B.4T07LuM-luc metastasis in each organ after in situ vaccination (total imaging); C.4T07LuM-luc metastasis in each organ after in situ inoculation (separate imaging)

2.5 4T07LuM細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)

4T07和4T07LuM兩株細(xì)胞在0、24、48 h時(shí)進(jìn)行細(xì)胞劃痕愈合檢驗(yàn)(圖5A)，4T07LuM組的劃痕愈合比例要明顯高于4T07組，24和48 h時(shí)4T07LuM細(xì)胞的遷移能力分別是親代細(xì)胞4T07的1.28(P<0.01)和1.64倍(P<0.001)。此外，與4T07相比，4T07LuM遷移過(guò)小室的結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)量顯著提高(圖5B)，4T07LuM細(xì)胞的遷移能力是親代細(xì)胞4T07的1.91倍(P<0.001)。

2.6 4T07LuM細(xì)胞的免疫微環(huán)境更傾向于免疫抑制狀態(tài)

原位接種4T07LuM細(xì)胞后，相較于親代細(xì)胞4T07，免疫微環(huán)境也發(fā)生了一定程度的改變。脾臟中CD4+和CD8+T細(xì)胞比例明顯降低(P<0.001,P<0.05)(圖6A)，原位灶中M2和B細(xì)胞的比例明顯上調(diào)(P<0.05,P<0.01)(圖6B)，肺轉(zhuǎn)移灶中CD4+和CD8+T細(xì)胞比例也明顯降低(P<0.001,P<0.05)(圖6C)。

3 討論

乳腺癌轉(zhuǎn)移是個(gè)復(fù)雜多級(jí)聯(lián)的過(guò)程，需要腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位進(jìn)行擴(kuò)散，滲透進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，然后外滲到遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移器官并且完成定植。乳腺癌轉(zhuǎn)移模型就是圍繞各個(gè)轉(zhuǎn)移步驟而建立的實(shí)驗(yàn)研究工具[7]?，F(xiàn)階段研究集中于腫瘤自身對(duì)轉(zhuǎn)移的影響，目前廣泛使用的人源性乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型MDA-MB-231-LM2細(xì)胞缺乏完整免疫系統(tǒng)背景[13]。而本研究篩選得到的4T07LuM，優(yōu)勢(shì)在于可以接種具有完全免疫的小鼠，更全面地反應(yīng)免疫微環(huán)境對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。本研究發(fā)現(xiàn)原位接種4T07LuM細(xì)胞后，正向殺傷腫瘤的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)減少，而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移、發(fā)揮免疫抑制作用的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)增多，腫瘤和肺臟的免疫微環(huán)境更傾向于免疫抑制的狀態(tài)。與本研究一致的是，原位灶和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移器官的免疫環(huán)境都影響腫瘤轉(zhuǎn)移的進(jìn)程，轉(zhuǎn)移性腫瘤相比原發(fā)性腫瘤具有更低的免疫原性[14]，而且肺作為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移器官接受腫瘤定植需要高度依賴免疫抑制的微環(huán)境[15]。4T07LuM細(xì)胞模型將免疫系統(tǒng)引入到轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)中，可以探究早期原位灶的腫瘤細(xì)胞如何逃脫免疫監(jiān)視進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，以及如何塑造遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移器官的免疫抑制微環(huán)境，并形成易于腫瘤定植的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位。

目前乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療效果不佳，部分原因是缺乏預(yù)測(cè)方法來(lái)確定患者哪些器官容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，故亟需器官特異性轉(zhuǎn)移模型的基礎(chǔ)研究為預(yù)防治療提供新靶點(diǎn)。本研究利用4T07細(xì)胞幾乎無(wú)法形成轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞特性，在接受多輪肺臟微環(huán)境“馴化”后，它的體外侵襲和遷移能力都顯著增強(qiáng)，進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果又顯示出其肺轉(zhuǎn)移的特異性，即肺臟高度轉(zhuǎn)移的同時(shí)卻在其他器官很少觀察到轉(zhuǎn)移灶的形成。相較于高轉(zhuǎn)移的4T1細(xì)胞原位肺轉(zhuǎn)移模型，4T07LuM細(xì)胞體現(xiàn)出微環(huán)境對(duì)肺轉(zhuǎn)移的影響，更容易富集到肺特異性轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因。由于4T07LuM細(xì)胞同時(shí)具備了肺特異性和高轉(zhuǎn)移性的特點(diǎn)，測(cè)序比較兩株細(xì)胞系4T07和4T07LuM可以尋找影響肺轉(zhuǎn)移的新型生物標(biāo)志物，為乳腺癌轉(zhuǎn)移的臨床診斷提供更豐富的依據(jù)和更準(zhǔn)確的治療策略。

圖4 4T07/4T07LuM細(xì)胞原位接種后肺的HE染色Fig 4 HE staining of lung after 4T07/4T07LuM cells inoculation in situ(×40; ×100; ×200)

A.wound healing assays of 4T07/4T07LuM cells(×40); B.Transwell assays of 4T07/4T07LuM cells(×100); *P<0.01, **P<0.001 compared with 4T07 group

此外本研究仍存在一些局限性，例如4T07LuM細(xì)胞作為小鼠乳腺癌細(xì)胞系，無(wú)法同基因工程模型小鼠一樣地準(zhǔn)確探究腫瘤休眠機(jī)制，而且乳腺癌的異質(zhì)性和臨床轉(zhuǎn)化的復(fù)雜性限制了該模型的應(yīng)用。

A.proportion of CD4+ and CD8+ T cells in spleen; B.proportion of M2 and B cells in tumor immune microenvironment; C.proportion of CD4+ and CD8+ T cells in metastasis; D.figure 6 (A-C) statistical results of immune cell infiltration; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 4T07 group

綜上所述，本研究建立了來(lái)自低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系分離出器官特異性的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系的一般方法，構(gòu)建并驗(yàn)證了4T07LuM細(xì)胞肺特異性轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系，為臨床轉(zhuǎn)移癌的研究提供了新實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>