沉默lnc-SLC2A12-10∶1抑制人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS增殖、遷移和侵襲

劉 磊，李世寶，張好良*

(1.徐州醫(yī)科大學(xué) 生理學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004； 2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 徐州 221002)

胃癌(gastric cancer)在中國(guó)惡性腫瘤中的發(fā)病率和病死率均居前列[1]，早期胃癌治療后5年生存率可超過(guò)90%，甚至治愈[2]，但中國(guó)早期胃癌的診治率低于10%。傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9、CA72-4敏感性和特異性均不高，因此，尋找其他非侵入性的生物標(biāo)志物篩選胃癌是非常必要的。外泌體中包含大量的蛋白質(zhì)和不同的RNA，它們可以調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的行為，并作為疾病的循環(huán)生物標(biāo)志物[3]。既往研究表明腫瘤源性外泌體中長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)含量較高[4]，不同lncRNA在腫瘤的進(jìn)展中可發(fā)揮促癌或抑癌的作用[5-8]。

Lnc-SLC2A12-10∶1在基因芯片、胃癌細(xì)胞和胃癌患者血清中外泌體中均高表達(dá)，提示lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮促癌基因的作用[9]。為進(jìn)一步研究lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌中的調(diào)控機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采取lnc-SLC2A12-10∶1基因干擾技術(shù)構(gòu)建lnc-SLC2A12-10∶1沉默的胃癌AGS細(xì)胞，探討lnc-SLC2A12-10∶1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和人胚胎腎上皮細(xì)胞系HEK-293T(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CCK-8試劑盒和Polybrene(徐州維科曼得生物工程有限公司)；Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠(Corning公司)；pLVX-shRNA2-Puro vector(湖南科愛(ài)醫(yī)療器械有限公司)；miRNA 引物第一鏈 cDNA 合成試劑盒和引物(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)的設(shè)計(jì)及制備：針對(duì)lnc-SLC2A12-10∶1的靶點(diǎn)，構(gòu)建shRNA片段序列(表1，shRNA由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)。Oligo片段兩兩配對(duì)，混勻后置于PCR儀中95 ℃, 5 min，室溫靜置20 min，形成雙鏈Oligo片段，經(jīng)酶切后連接于載體上構(gòu)建pLVX-shRNA-Puro。

1.2.2 慢病毒包裝：將HEK-293T細(xì)胞按2.5×106個(gè)/mL的濃度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，過(guò)夜培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度在70%～80%開(kāi)始按操作手冊(cè)包裝病毒。6 h后，更換新鮮DMEM完全培養(yǎng)基。24 h后在熒光顯微鏡下觀察報(bào)告基因(ZsGreen1)表達(dá)情況，判斷感染效率。在48、72和96 h連續(xù)3次收集病毒原液。將收集的原液 2 000×g離心5 min，去除細(xì)胞碎片，上清經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾。

1.2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染多克隆AGS細(xì)胞的篩選：將胃癌AGS細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔接種在6孔板中，第2天細(xì)胞匯合度在50%～70%可進(jìn)行慢病毒感染。每孔加入50 μL慢病毒和1 μL Polybrene混勻，8 h后換成完全培養(yǎng)基。24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察ZsGreen1的表達(dá)情況，判斷感染效率。感染48 h后換成含0.5 μg/mL嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)傳代，待細(xì)胞感染率達(dá) 80% 時(shí)結(jié)束篩選。按照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行RT-qPCR并觀察干擾效率。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖：96孔板每孔加100 μL細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104個(gè)/mL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每組細(xì)胞設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在22、46 h更換培養(yǎng)基為CCK-8懸液(100 μL完全培養(yǎng)基+10 μL CCK-8液/孔)，置于培養(yǎng)箱作用2 h后，在酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔吸光度(A)值。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移：將細(xì)胞按1×106個(gè)/mL鋪于6孔板中，待細(xì)胞貼壁并增殖滿后，棄去培養(yǎng)基，用10 μL槍頭進(jìn)行劃痕， PBS清洗3次， 去除劃下的細(xì)胞，加入1% FBS血清濃度的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。 0、24 和48 h分別于相同位置拍照并分析。

表1 Lnc-SLC2A12-10∶1 shRNA片段序列Table 1 Sequences of lnc-SLC2A12-10∶1 shRNA fragment

1.2.6 Transwell小室法檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移：在24孔板中加入完全培養(yǎng)基，放入Transwell小室，小室內(nèi)加入200 μL細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞為2×105個(gè)/mL，培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)基，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3次，將小室翻轉(zhuǎn)晾干；0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min，用PBS清洗3次，用棉簽輕輕擦掉上室殘留細(xì)胞。倒置顯微鏡觀察拍照，200倍鏡下取孔的上、下、左、右、中5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，并計(jì)算平均值。

1.2.7 Transwell小室法檢測(cè)胃癌細(xì)胞侵襲：提前將Matrigel基質(zhì)膠放在4 ℃過(guò)夜融化。將Transwell放入24孔板，將Matrigel基質(zhì)膠與預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基按1∶5體積稀釋，取100 μL稀釋膠加入Transwell上室，然后于培養(yǎng)箱中靜置3 h，使Matrigel膠凝固。向Transwell上室加入細(xì)胞懸液100 μL，下室加入800 μL完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)基，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3次，將小室翻轉(zhuǎn)晾干；0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min，用PBS清洗3次，用棉簽輕輕擦掉上室殘留細(xì)胞。倒置顯微鏡觀察拍照，200倍鏡下取孔的上、下、左、右、中5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，并計(jì)算平均值。

1.2.8 Lnc-SLC2A12-10∶1靶向微小RNA(micro RNA,miRNA)軟件預(yù)測(cè)和熒光定量 PCR 驗(yàn)證:根據(jù)lnc-SLC2A12-10∶1序列，用生物信息預(yù)測(cè)軟件(上海伯豪生物科技公司)預(yù)測(cè)可能的靶向miRNA。使用miRNA 第一鏈 cDNA 合成試劑盒，按試劑說(shuō)明書(shū)操作，獲得miRNA cDNA。再用表2引物序列進(jìn)行RT-qPCR 驗(yàn)證，以U6為內(nèi)參，鐵蛋白重鏈1(ferritin heavy chain 1，F(xiàn)TH1)為lnc-SLC2A12-10∶1親本基因，結(jié)果基于2-△△Ct法計(jì)算，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Lnc-SLC2A12-10∶1干擾的胃癌AGS細(xì)胞株的建立和鑒定

轉(zhuǎn)染48 h后觀察綠色熒光ZsGreen1的表達(dá)情況，各組轉(zhuǎn)染效率均在80%以上(圖1)。shRNA1、shRNA2、shRNA3(short hairpin RNA)均能有效干擾lnc-SLC2A12-10∶1的表達(dá)，shRNA2敲減效果最為明顯，因此選擇shRNA2組進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表2 預(yù)測(cè)miRNA和lnc-SLC2A12-10∶1親本基因引物

2.2 敲低lnc-SLC2A12-10∶1對(duì)AGS細(xì)胞增殖的影響

48 和72 h時(shí)lnc-SLC2A12-10∶1 shRNA2組較AGS NC組A值明顯降低(圖2)(P<0.05)。

2.3 沉默lnc-SLC2A12-10∶1對(duì)AGS細(xì)胞遷移的影響

與對(duì)照組細(xì)胞比較，沉默lnc-SLC2A12-10∶1后，細(xì)胞劃痕愈合減慢(圖3)(P<0.05)，遷移到Transwell下室的細(xì)胞量明顯減少(圖4)(P<0.05)。

2.4 沉默lnc-SLC2A12-10∶1對(duì)AGS細(xì)胞侵襲的影響

與對(duì)照組相比，沉默lnc-SLC2A12-10∶1后AGS細(xì)胞的侵襲能力明顯減低(圖5)(P<0.05)。

2.5 Lnc-SLC2A12-10∶1靶向miRNA熒光定量 PCR 驗(yàn)證

根據(jù)軟件預(yù)測(cè)，lnc-SLC2A12-10∶1可能的靶向miRNA是hsa-miR-105-5p、hsa-miR-150-3p、hsa-miR-449b-3p、hsa-miR-588、hsa-miR-1275和hsa-miR-4701-5p。沉默lnc-SLC2A12-10∶1后，lnc-SLC2A12-10∶1的親本基因FTH1表達(dá)增加(P<0.05)，同時(shí)hsa-miR-105-5p和hsa-miR-150-3p的表達(dá)也明顯增多(P<0.05)(圖6)。

*P<0.05 compared with NC group, scale bar=100 μm圖1 不同lnc-SLC2A12-10∶1 shRNA轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞后的熒光效果及干擾效率

*P<0.05 compared with NC group圖2 CCK-8法檢測(cè)沉默lnc-SLC2A12-10∶1對(duì)AGS細(xì)胞增殖的影響Fig 2 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on proliferation of AGS cells detected by CCK-8

3 討論

胃癌的形成涉及到原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及表觀遺傳學(xué)調(diào)控等。近年來(lái)，大量研究證實(shí)lncRNA在胃癌的發(fā)生發(fā)展以及介導(dǎo)治療耐藥性等方面中起到重要的作用。Lnc-CTSLP4可抑制胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)化[10]；沉默lncRNA TRPM2-AS可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、 轉(zhuǎn)移和放射抵抗[11]等。因此，尋找診斷l(xiāng)ncRNA標(biāo)志物及研究其調(diào)控機(jī)制，為胃癌診斷和治療提供新的靶點(diǎn)，將具有巨大的臨床應(yīng)用前景和社會(huì)效益。

*P<0.05 compared with NC group, scale bar=200 μm圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默lnc-SLC2A12-10∶1對(duì)AGS細(xì)胞遷移的影響Fig 3 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on AGS cell migration detected by wound healing

*P<0.05 compared with NC group, scale bar=200 μm圖4 Transwell小室法檢測(cè)沉默lnc-SLC2A12-10∶1對(duì)AGS細(xì)胞遷移的影響Fig 4 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on AGS cell migration detected by Transwell assay n=3)

*P<0.05 compared with NC group, scale bar=200 μm圖5 Transwe小室法檢測(cè)沉默lnc-SLC2A12-10∶1對(duì)AGS細(xì)胞侵襲的影響Fig 5 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on AGS cell invasion detected by Transwell assay n=3)

*P<0.05 compared with NC group圖6 沉默lnc-SLC2A12-10∶1對(duì)預(yù)測(cè)miRNA和親本基因的影響Fig 6 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on predicted miRNA and parental gene

Lnc-SLC2A12-10∶1是新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，位于6號(hào)染色體，含有1個(gè)外顯子，是lncRNA，全長(zhǎng)701 bp。前期研究發(fā)現(xiàn)lnc-SLC2A12-10∶1高表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)[9]，但lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌中的功能未見(jiàn)報(bào)道。本課題組通過(guò)設(shè)計(jì)lnc-SLC2A12-10∶1干擾序列構(gòu)建沉默細(xì)胞株，進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，敲減lnc-SLC2A12-10∶1之后，AGS細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力都受到抑制，表明lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮促癌的作用。

LncRNA發(fā)揮功能，通常是通過(guò)序列特異性和構(gòu)象結(jié)合與DNA、RNA和蛋白質(zhì)相互作用，發(fā)揮支架、誘餌(分子壑或miR吸附)和RNA增強(qiáng)作用[12-13]。檢索ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，lnc-SLC2A12-10∶1屬于假基因(pseudogene)鐵蛋白重鏈1假基因26(ferritin heavy chain 1 pseudogene 26，F(xiàn)TH1P26)。假基因轉(zhuǎn)錄本最近被證明可以發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)作用吸附miRNA，從而調(diào)控親本基因的表達(dá)[14]。通過(guò)生物信息預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)lnc-SLC2A12-10∶1可能的靶向miRNA是hsa-miR-105-5p、hsa-miR-150-3p、hsa-miR-449b-3p、hsa-miR-588、hsa-miR-1275和hsa-miR-4701-5p。沉默lnc-SLC2A12- 10∶1后，lnc-SLC2A12-10∶1的親本基因FTH1表達(dá)恢復(fù)，同時(shí)hsa-miR-105-5p和hsa-miR-150-3p表達(dá)也明顯增加，提示hsa-miR-105-5p和hsa-miR-150-3p可能是lnc-SLC2A12-10∶1的靶向miRNA，并參與lnc-SLC2A12-10∶1對(duì)親本基因FTH1的調(diào)控。

綜上，本研究成功構(gòu)建了lnc-SLC2A12-10∶1沉默的胃癌細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮促癌作用，若在腫瘤微環(huán)境中進(jìn)行靶向敲除，理論上將會(huì)提高胃癌治療效果。鑒于lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的重要作用，其具體作用和機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。