Lnc000727促進人骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化

蒲 超，張珊珊，吳青霞，羅栩偉，王 亮，張 波*

(川北醫(yī)學院第二臨床學院南充市中心醫(yī)院 1.骨科; 2.神經(jīng)內(nèi)科， 四川 南充 637000)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是一種與年齡相關(guān)的系統(tǒng)性骨骼疾病，表現(xiàn)為低骨量和骨組織的微結(jié)構(gòu)性退化，患者發(fā)生骨折的風險較高。全球有超過2億人患有這種疾病，而且這一數(shù)字正在逐步增加[1]。盡管近年來已經(jīng)進行了許多關(guān)于骨質(zhì)疏松癥的研究，但是需要探索更有效的骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療靶標[2]。骨質(zhì)與脂肪量之間的失衡是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機制的典型特征[3]。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)是具有自我更新和多重分化能力的干細胞。BM-MSCs作為成骨細胞和脂肪細胞的主要來源，維持成骨細胞和脂肪細胞之間的平衡。最近的研究表明，BM-MSCs異常分化能力在骨質(zhì)疏松癥的這一關(guān)鍵發(fā)病機制中起著重要作用[4]。因此，確定成骨細胞和脂肪細胞分化的這些關(guān)鍵靶點將對骨質(zhì)疏松癥的早期診斷和治療大有幫助。長非編碼RNA(long noncadling RNA,lncRNA)是一種長于200 nt的RNA分子，不具有蛋白質(zhì)編碼潛能。LncRNA在細胞生物學中的各種重要功能已在眾多研究中得到證明[5]。先前的研究表明lncRNA參與BM-MSCs成骨細胞和脂肪細胞的分化[6]。近期發(fā)現(xiàn)lnc000727在骨質(zhì)疏松患者血清中的表達異常升高，提示其可能在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生中起重要作用，可能有助于開發(fā)骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療標志物[7]。然而，lnc000727在骨質(zhì)疏松癥中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探究lnc000727對成骨細胞分化的影響及潛在機制，以期為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

人骨髓間充質(zhì)干細胞hBM-MSCs(中國科學院細胞庫)；α-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone公司)；胰蛋白酶和青霉素-鏈霉素雙抗(Gibco公司)；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)；lnc000727過表達載體質(zhì)粒及空載、lnc000727 siRNA和siRNA control(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)；β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸和地塞米松(Sigma-Aldrich公司)；Trizol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)檢測試劑盒(南京建成生物科技公司)；RIPA裂解液、BCA試劑盒和ECL化學發(fā)光試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)；RUNX2、OCN、OPN、Wnt和β-catenin單克隆抗體(CST公司)；辣根過氧化物酶標記的IgG(北京中杉金橋生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組和處理：將BM-MSCs培養(yǎng)在α-MEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和100 U/mL青-鏈霉素雙抗)中，于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代。對數(shù)期的BM-MSCs種植到6孔板中，種植細胞數(shù)為1×105個/孔，待細胞增殖至匯合80%時行轉(zhuǎn)染處理，分別將lnc000727過表達載體質(zhì)粒、空載、lnc000727 siRNA和siRNA control轉(zhuǎn)染至BM-MSCs，具體操作參照Lipofectamine 3000照轉(zhuǎn)染試劑制造商使用說明進行，其中轉(zhuǎn)染lnc000727過表達載體質(zhì)粒的hBMSC記為lnc000727組，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的BM-MSCs記為pcDNA組，轉(zhuǎn)染lnc000727 siRNA的BM-MSCs記為si-lnc000727組，轉(zhuǎn)染siRNA control的BM-MSCs記為si-NC組。轉(zhuǎn)染6 h后更換成含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染72 h后采用RT-qPCR檢測lnc000727的表達水平，選擇成功過表達和抑制lnc000727的細胞株進行成骨細胞分化誘導，誘導培養(yǎng)14 d。成骨細胞分化誘導時，按照參考文獻[8]在培養(yǎng)液中添加10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油、50 μg/mL抗壞血酸，每隔1 d更換1次培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)21 d。并以未成骨分化誘導的BM-MSCs作為對照(即0 d組)。

1.2.2 酶標儀檢測ALP活性：按照ALP檢測試劑盒測定ALP活性。簡言之，將細胞用PBS洗滌3次/5 min，然后加入適量的對甲苯胺藍/四唑氮藍(BCIP/NBT)染色液。將樣品在室溫下在黑暗中孵育20 min，直到顏色變深，除去工作液，并用蒸餾水洗滌細胞兩次以終止反應，并使用酶標儀測定ALP活性。

1.2.3 RT-qPCR檢測lnc000727、RUNX2、OCN和OPN mRNA的表達：Trizol法抽提RNA，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，按照試劑盒使用說明進行擴增。反應結(jié)束后分別獲取Ct值，以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析lnc000727的相對表達水平。引物如下：lnc000727上游引物：5′-CAGCTCGTTCATGGATG CAA-3′，下游引物：5′-GAGAGATGTCATTGCCGCAG-3′；β-actin上游引物：5′-TGGACTTCGAGCAAGAGA TG-3′，下游引物：5′-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′；Runx2上游引物：5′-CCGCCTCAGTGATTTAG GGC-3′，下游引物：5′-GGGTCTGTAATCTGACTCT GTCC-3′；OCN上游引物：5′-CACTCCTCGCCCTATT GGC-3′，下游引物：5′-CCCTCCTGCTTGGACACAA AG-3′；OPN上游引物：5′-ACTCCAATCGTCCCTA CAGTC-3′，下游引物：5′-GACTCACCGCTCTTCATG TG-3′。

1.2.4 Western blot檢測RUNX2、OCN、OPN、Wnt和β-catenin蛋白表達：收集各組BM-MSCs，在含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液中裂解細胞抽提總蛋白，BCA檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，蛋白質(zhì)采用SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜用含脫脂奶粉的封閉液進行封閉，將膜浸入稀釋的相應一抗(其中RUNX2、OCN、OPN一抗均為1∶800稀釋，Wnt和β-catenin單抗為1∶500稀釋)溶液中，4 ℃過夜，洗滌膜后再浸入到1∶3 000稀釋的二抗溶液中，室溫孵育2 h，使用化學發(fā)光試劑檢測蛋白質(zhì)信號，以GAPDH進行標定。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 人BM-MSCs成骨細胞分化誘導過程中l(wèi)nc000727的表達變化

與0 d相比，BM-MSCs在成骨細胞分化誘導第3、7、14、21 d時lnc000727的表達水平和ALP活性均顯著升高(P<0.05)(圖1)。

2.2 抑制或過表達lnc000727對ALP活性的影響

與si-NC組相比，si-lnc000727組轉(zhuǎn)染lnc000727 siRNA 72 h后BM-MSCs中l(wèi)nc000727的表達顯著降低(P<0.05)，成骨分化誘導14 d時ALP活性明顯下降(P<0.05)；與pcDNA組相比，lnc000727組轉(zhuǎn)染lnc000727 過表達質(zhì)粒72 h后BM-MSCs中l(wèi)nc000727的表達顯著升高(P<0.05)，成骨分化誘導14 d時ALP活性明顯上升(P<0.05)(圖2)。

2.3 抑制或過表達lnc000727對BM-MSCs成骨分化標志物表達的影響

與si-NC組相比，si-lnc000727組中RUNX2、OCN和OPN mRNA和蛋白的表達明顯下調(diào)(P<0.05)；與pcDNA組相比，lnc000727組中RUNX2、OCN和OPN mRNA和蛋白的表達明顯上調(diào)(P<0.05)(圖3，4)。

*P<0.05 compared with 0 day圖1 人BM-MSCs向成骨細胞分化過程中的lnc000727表達和ALP活性變化

*P<0.05 compared with si-NC group； △P<0.05 compared with pcDNA group圖2 各組中l(wèi)nc000727的表達和ALP活性比較Fig 2 Comparison of lnc000727 expression and ALP activity in each group n=3)

*P<0.05 compared with si-NC group；△P<0.05 compared with pcDNA group圖3 Western blot檢測成骨分化標志物RUNX2、OCN和OPN的表達

*P<0.05 compared with si-NC group；△P<0.05compared with pcDNA group圖4 各組中成骨分化標志物RUNX2、OCN和OPN mRNA表達水平比較Fig 4 Comparison of mRNA expression levels of osteogenic differentiation markers RUNX2, OCN and OPN in each group n=3)

2.4 抑制或過表達lnc000727對Wnt/β-catenin信號通路激活的影響

與si-NC組相比，si-lnc000727組中Wnt和β-catenin的表達明顯下調(diào)(P<0.05)；與pcDNA組相比，lnc000727組中Wnt和β-catenin的表達明顯上調(diào)(P<0.05)(圖5)。

3 討論

早期診斷和治療骨質(zhì)疏松癥可以幫助減輕疼痛和癥狀，并有助于及時的醫(yī)療干預。此外，探索引起骨質(zhì)疏松癥的特定基因和確定新的治療靶標尤為重要。近期隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)了lncRNA，并很快發(fā)現(xiàn)了它們的作用以及與各種細胞功能和病理狀況的關(guān)聯(lián)。盡管尚未完全闡明lncRNA功能方面的機制細節(jié)，但報告仍為它們與成骨基因調(diào)控及其發(fā)病機制提供了強有力的指示[9-10]。作為成骨細胞和脂肪細胞的主要來源細胞，BM-MSCs在體內(nèi)和體外均能拮抗成骨細胞或脂肪細胞的分化。從生理上講，這些分化能力處于平衡狀態(tài)，并受包括lncRNA在內(nèi)的各種檢查點分子的調(diào)節(jié)。然而，這些檢查點分子的異常表達可能破壞分化平衡，導致異常的骨代謝以及疾病發(fā)展[11]。例如，lncRNA H19可以通過miR-29a-3p改變海綿狀結(jié)構(gòu)與軟骨再生相關(guān)來調(diào)節(jié)成骨作用。此外，在骨關(guān)節(jié)炎患者中發(fā)現(xiàn)H19表達異常[12]。有證據(jù)表明，lncRNA GAS5在骨質(zhì)疏松癥患者的骨組織和成骨細胞的主要來源BM-MSCs中均降低，GAS5均可正向調(diào)節(jié)成骨細胞的分化[13]。本實驗首次證實lnc000727能夠通過Wnt/β-catenin信號通路促進BM-MSCs成骨細胞分化，抑制骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展。

*P<0.05 compared with si-NC group；△P<0.05 compared with pcDNA group圖5 Western blot檢測Wnt和β-catenin的表達Fig 5 Western blot detection of Wnt and β-catenin expression n=3)

許多研究已經(jīng)證實骨質(zhì)疏松癥患者的骨髓間充質(zhì)干細胞具有降低的成骨能力，這是導致骨量異常減少的重要原因[14]。但是，尚不清楚lnc000727是否參與了這些過程。本實驗結(jié)果顯示，在BM-MSCs向成骨細胞分化過程中l(wèi)nc000727的表達逐漸升高，提示lnc000727可能與骨質(zhì)疏松癥的進展有關(guān)。此外，功能實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達lnc000727能夠明顯促進ALP活性，并促進關(guān)鍵的成骨標志物RUNX2、OCN和OPN的表達，而抑制lnc000727則表現(xiàn)出相反的結(jié)果。以上這些結(jié)果提示，過表達或抑制lnc000727能夠促進或抑制成骨細胞的分化。此外，本實驗檢測了成骨細胞分化的關(guān)鍵信號通路Wnt/β-catenin相關(guān)蛋白分子Wnt和β-catenin的表達，結(jié)果顯示，過表達lnc000727可促進Wnt和β-catenin的表達，而抑制lnc000727能夠阻礙Wnt和β-catenin的表達，這表明lnc000727可能促進Wnt/β-catenin信號通路的活化。

總之，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)lnc000727在骨質(zhì)疏松癥患者骨組織中的表達顯著升高，且lnc000727能夠促進成骨細胞的分化，進而抑制骨質(zhì)疏松癥的進程。本研究表明靶向lnc000727可能有助于骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療。