新型微量注射裝置在建立帕金森病模型小鼠中的應(yīng)用

左賦興，苑 青，蔡洪慶，韓睿欽，萬經(jīng)海

(1.國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 腫瘤醫(yī)院 神經(jīng)外科，北京 100021；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是常見的運(yùn)動障礙性疾病，嚴(yán)重威脅60歲以上人群的健康[1]。動物模型是疾病研究的重要工具，其中6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)小鼠單側(cè)紋狀體注射是構(gòu)建PD模型小鼠常用的方法之一[2-6]，通過觀測行為學(xué)表現(xiàn)和酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)免疫組化染色來評估模型效果[3, 7]。該P(yáng)D模型制作的關(guān)鍵是精準(zhǔn)微創(chuàng)穿刺小鼠紋狀體特定位置[4, 6]。普通微量注射器穿刺損傷大，嚴(yán)重影響模型的一致性和穩(wěn)定性。本研究應(yīng)用新型微量注射裝置進(jìn)行6-OHDA腦內(nèi)注射，從行為學(xué)和形態(tài)學(xué)等方面探討其建模效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級10周齡健康雌性C57BL/6J小鼠20只，體質(zhì)量20～25 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。動物飼養(yǎng)及相關(guān)實驗在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實驗動物中心[SYXK(京)2019-0019]實施。動物實驗全過程遵照實驗動物操作指南，并經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)[NCC2020A200]。隨機(jī)分為對照組和實驗組，每組10只小鼠，分別用普通微量注射器(對照組)和新型微量注射裝置(實驗組)進(jìn)行單側(cè)紋狀體6-OHDA注射。

1.2 實驗器械

體視鏡(Olympus公司)；Eclipse 90i顯微鏡(Nikon公司)；Stereo Investigator(Micro-Bright Field Bioscience公司)；激光共聚焦顯微鏡、冰凍切片機(jī)(Leica公司)；OCT冷凍切片包埋劑(Sakura公司)；用于顱內(nèi)立體定向注射的微量注射裝置(ZL201520328267.3)(圖1A)、微量注射器(Hamilton公司)；微量注射泵(蘭格恒流泵有限公司)；立體定向儀、動物手術(shù)器械、牙科磨鉆(Stoelting公司)；P40 pro智能手機(jī)(華為技術(shù)有限公司)。

1.3 主要藥品及試劑

6-OHDA、地昔帕明(desipramine)、抗壞血酸(ascorbic acid)、阿撲嗎啡(Apomorphine, Apo)(Sigma-Aldrich公司)；10%水合氯醛溶液(中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)；Vectastain Elite ABC Kit (Universal)、封閉用馬血清(Vector laboratories公司)；兔抗酪氨酸羥化酶(TH)抗體、兔抗SRY-box轉(zhuǎn)錄因子2(SRY-box transcription factor 2, Sox-2)抗體、雞抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗體(Millipore公司)；Alexa Fluor? 594 goat anti-chicken二抗、Alexa Fluor? 647 donkey anti-rabbit二抗(Life Technologies公司)；蘇木精(北京化工廠有限責(zé)任公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備:6-OHDA單側(cè)紋狀體注射如前述[2]。實驗前30 min小鼠腹腔注射地昔帕明(0.01 mL/g 體質(zhì)量)。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后將小鼠固定于立體定向儀上。消毒并切開頭皮顯露前囟點，于前囟點前0.9 mm、左側(cè)旁開2.2 mm處鉆孔。實驗組以新型微量注射裝置緩慢下行穿刺至硬膜下2.5 mm緩慢注射6-OHDA溶液(含0.02%抗壞血酸)3 μL(注射泵速度0.5 μL/min)，注射完畢后留針2 min。緩慢勻速撤出注射裝置并縫合頭皮。對照組以普通微量注射器操作。

1.4.2 旋轉(zhuǎn)實驗:建模后7 d，觀察小鼠有無尾僵豎毛等異常行為，并于建模后7 和28 d進(jìn)行旋轉(zhuǎn)實驗。小鼠腹腔注射Apo溶液后(5 μg/g體質(zhì)量)，將動物單只置于籠中，手機(jī)攝像連續(xù)記錄30 min內(nèi)小鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。

1.4.3 免疫組化染色:建模后28 d用10%水合氯醛過量麻醉小鼠后，行4%多聚甲醛心臟灌注和腦組織固定。30%蔗糖溶液脫水后包埋于OCT中，冰凍切片機(jī)冠狀位連續(xù)切片，厚度30 μm，置于切片抗凍劑中-20 ℃保存。取中腦黑質(zhì)層面腦片行TH染色(一抗稀釋濃度1∶800)，顯色后蘇木精復(fù)染，封片并在體視鏡下觀察計數(shù)。取紋狀體層面腦片行GFAP(glial fibrillary acidic protein)和Sox2免疫熒光染色(一抗稀釋濃度分別為1∶600和1∶100)，二抗孵育后抗淬滅劑封片并在激光共聚焦顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)表現(xiàn)

實驗組小鼠在觀察周期內(nèi)均存活，建模后7 d，尾僵豎毛等異常行為發(fā)生率為90%(9/10)；6-OHDA注射后7和28 d均可被Apo誘導(dǎo)出現(xiàn)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)行為(100%)，30 min平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)分別為189.4 ± 12.8和195.2 ± 12.7(n=10)(圖1B)。對照組動物建模后7 d內(nèi)死亡2只，其余存活小鼠尾僵豎毛等異常行為發(fā)生率為75%(6/8)；建模后出現(xiàn)Apo誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為5只(62.5%)，7和28 d的平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)分別為173.6 ± 20.5和139.2 ± 24.1(n=5,P<0.05)；建模28 d旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少，與實驗組統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.05)(圖1B)。

2.2 免疫組化染色

與對照組相比，建模后28 d實驗組小鼠患側(cè)黑質(zhì)TH陽性的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量為(2 502.0±505.9)個(n=10)，較對照組(3 792.9±1 048.3)個(n=5)顯著減少(P<0.05)(圖2A～C)。此外，對照組患側(cè)紋狀體內(nèi)反應(yīng)性增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，且部分具有神經(jīng)前體細(xì)胞特性，表達(dá)Sox2(圖2D)，提示對照組機(jī)械損傷大，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活。

3 討論

小鼠腦內(nèi)立體定向注射6-OHDA是研究PD的常用模型之一，模型制作易操作，動物異常行為穩(wěn)定持續(xù)時間長[3-4]。其最大優(yōu)勢在于可形成自身對照，注射側(cè)多巴胺能神經(jīng)元大量死亡，Apo誘發(fā)小鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與損傷程度正相關(guān)，便于進(jìn)行模型量化評價[3, 6]。且6-OHDA在腦內(nèi)形成的病理生理反應(yīng)漸進(jìn)而穩(wěn)定，與人類PD的疾病過程更接近[6-7]。但6-OHDA不能透過血腦屏障，必須直接腦內(nèi)給藥。該P(yáng)D模型的制作需要在立體定向儀器引導(dǎo)下穿刺小鼠腦內(nèi)特定坐標(biāo)點，緩慢注射6-OHDA，使藥物與腦內(nèi)微環(huán)境充分接觸并有效彌散，從而發(fā)揮毒性作用[2-3, 5]。

模型動物的基本要求是一致性和穩(wěn)定性[3-5]。

A.higher magnification image demonstrated that the diameter of the glass cannula tip was 30 μm, which was much smaller than regular Hamilton syringe, resulting in mild impairment; B.6-OHDA-induced lesioning at day 7 in both control and experimental groups could be observed, while significant reduction in the number of rotations was detected in control mice; *P<0.05 compared with control

The overall number of dopaminergic neurons in the substantia nigra in experimental mice (A) was still smaller than that of cells in control animals (B); quantification of nigral TH positive cells (C) revealed significant difference between these two groups; more reactive astrocytes (D, red) were observed in the striatum of control mice, some of which co-localized with Sox2 (D, green) (arrows in D);*P<0.05 compared with control, two tailed Student’s t-test； scale bars represent 200 μm in (A, B); scale bar=20 μm in (A,B,D)

小鼠紋狀體體積較小，操作精度要求高。但普通微量注射器針頭尖端為斜口狀，直徑約500 μm，且為金屬材質(zhì)，進(jìn)入腦組織后機(jī)械損傷大，易導(dǎo)致動物死亡，不符合PD病理改變，更不利于后續(xù)實驗。本研究的對照組動物死亡率達(dá)20%，免疫組化提示穿刺部位周圍大量增生星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此損傷范圍大和腦水腫是動物死亡主要原因。對照組小鼠僅5只(50%)出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為，模型一致性差；且28 d的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較7 d顯著下降，模型穩(wěn)定性不佳。

為解決上述問題，實驗組應(yīng)用新型微量注射裝置(圖1A)以提高模型制作成功率。該裝置主要由無菌玻璃針組成，神經(jīng)組織相容性好；注射器連接微量進(jìn)樣泵，可穩(wěn)定微調(diào)6-OHDA注入速度，操作便捷；玻璃針尖端直徑僅30 μm，腦損傷極小，有效降低了建模后動物死亡率。實驗組小鼠在觀察周期內(nèi)無死亡，尾僵豎毛等PD相關(guān)癥狀發(fā)生率為90%；所有動物均在Apo誘導(dǎo)下出現(xiàn)典型旋轉(zhuǎn)行為，建模28 d和7 d的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，從動物行為層面提示模型一致性和穩(wěn)定性俱佳。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，實驗組黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量較對照組處于穩(wěn)定低水平，進(jìn)一步證實新型微量注射裝置可提高模型動物制作成功率。

綜上所述，實驗組模型動物成功率為100%，因此本研究推薦在腦內(nèi)注射6-OHDA制備PD模型小鼠時應(yīng)用該新型微量注射裝置，為后續(xù)疾病治療相關(guān)研究提供高效實驗工具。今后更可利用該裝置開展動物腦內(nèi)干細(xì)胞移植工作，觀察評估其在促進(jìn)移植成功率等方面的作用。