去泛素化酶OTUB1參與細(xì)胞銅缺乏的應(yīng)答

張宇飛，朱基彥，瞿思遙，張祝琴，劉德培

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005)

心血管疾病是一類常見的疾病，其發(fā)病在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，是造成殘疾和死亡的主要原因之一[1]。臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，缺血性心臟病和心肌肥厚過程中銅含量降低， 銅耗盡參與了缺血性心臟病和心肌肥厚的發(fā)病進(jìn)程[2-3]。在臨床上，銅缺乏也是心血管疾病發(fā)生的誘因之一。銅元素是動(dòng)物生長發(fā)育必需的微量營養(yǎng)素，它可以作為機(jī)體代謝所需的多種關(guān)鍵酶的輔助因子[4]。體內(nèi)的銅代謝受到多種銅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的嚴(yán)密調(diào)控，其中銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(copper transporter 1，CTR1)負(fù)責(zé)將銅從細(xì)胞外運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)[5]。日常銅攝入不足或銅代謝相關(guān)基因如Ctr1的突變或缺失均會(huì)導(dǎo)致銅的缺乏。目前已有報(bào)道，心臟特異性敲除Ctr1的小鼠心臟中銅含量降低，導(dǎo)致了心肌肥厚的發(fā)生，但分子機(jī)制尚未闡明[6]。因此，本文構(gòu)建了Ctr1敲除的H9c2細(xì)胞株，探究是否存在銅依賴的酶參與細(xì)胞銅缺乏的應(yīng)答，從而參與銅缺乏引起的心肌肥厚的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:原代大鼠心肌細(xì)胞系H9c2購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料:DMEM高糖培養(yǎng)基，PBS(賽維爾生物科技公司)；0.25%胰蛋白酶(北京雷根生物技術(shù)公司)；胎牛血清(GE Healthcare公司)；青霉素-鏈霉素-兩性霉素(北京索萊寶科技公司)；多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(國家有色金屬及電子分析測(cè)試中心)；RNA提取試劑盒(上海奕杉生物科技公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；Taq Pro Universal SYBR(南京諾唯贊生物科技公司)；四硫鉬酸鹽(tetrathiomolybdate，TTM)、咪唑(Sigma-Aldrich公司)；Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑，BCA檢測(cè)試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；PVDF膜、Ni NTA Binding Resin(Millipore公司)；β-actin抗體、GAPDH抗體(Abclonal公司)；CTR1抗體(Proteintech公司)；OTUB1抗體(Abcam公司)；Ubiquitin抗體(Santa Cruz公司)；K48 linkage ubiquitin抗體、K63 linkage ubiquitin抗體、mTOR抗體，p-mTOR抗體、p70S6K抗體和p-p70S6K抗體(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1Ctr1-/-的H9c2細(xì)胞株構(gòu)建:H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含三抗和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。細(xì)胞操作的全過程在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。使用Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑將Ctr1敲除載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，經(jīng)流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)篩選獲得單克隆細(xì)胞。待細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增至105數(shù)量級(jí)，提取基因組DNA，對(duì)切割位點(diǎn)處進(jìn)行測(cè)序，篩選出Ctr1純合敲除的H9c2細(xì)胞。sgRNA(small guide RNA)序列上游引物：5′-CACCGTGGTGATGTT GTCGTCCGTG-3′，下游引物5′-AAACCACGGACGAC AACATCACCAC-3′。

1.2.2 電感耦合等離子質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)檢測(cè)細(xì)胞中銅含量:將細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶充分消化下來，使用PBS清洗干凈。重懸細(xì)胞后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。之后放入離心機(jī)中，800 r/min離心5 min，吸出棄去上層液體。在細(xì)胞沉淀中，加入30～50 μL 65%濃硝酸。充分吹打混勻，使細(xì)胞充分溶解，直至無沉淀為止。根據(jù)細(xì)胞溶液體積加入去離子水，將硝酸濃度稀釋至1%。將5%硝酸濃度的多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(Cu、Fe、Zn)稀釋至1%，然后用1%稀硝酸配制梯度濃度的金屬離子標(biāo)準(zhǔn)品。將樣品置于ICP-MS中上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終計(jì)算出各樣品中銅的含量。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)檢測(cè)基因表達(dá):棄去培養(yǎng)基，使用PBS充分清洗細(xì)胞。使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的RNA。測(cè)量RNA濃度。然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA配制成20 μL體系， 置于PCR擴(kuò)增儀反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取1 μL cDNA模板，加入Taq Pro Universal SYBR酶、上下游引物和水配制為20 μL體系，置于熒光定量擴(kuò)增儀中進(jìn)行qPCR反應(yīng)。根據(jù)2-△△Ct計(jì)算基因的差異表達(dá)倍數(shù)。引物序列如下：Gapdh上游引物5′-TGACA ACTCCCTCAAGAT TGTCA-3′，下游引物5′-GGCAT GGACTGTGGTCATGA-3′；Ctr1上游引物5′-CTTGC CCTGGGAAGACCTTT-3′，下游引物5′-TTGTCGTCCG TGTGGTTCAT-3′。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平:向RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，提取細(xì)胞總蛋白。提取后使用超聲破碎儀處理樣品2 min，置于低溫離心機(jī)中，12 000 r/min離心2 min。收集上清蛋白質(zhì)溶液。使用BCA試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。向蛋白質(zhì)中加入SDS上樣緩沖液，沸水浴5 min。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，將蛋白質(zhì)樣品加入上樣孔中，60 V電泳1 h，隨后120 V電泳直至條帶充分分開。使用濕轉(zhuǎn)法，300 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h，將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。然后將膜置于含5%脫脂牛奶的TBST中封閉1 h。取出膜條，用TBST清洗3次，隨后置于一抗中4 ℃孵育過夜。用TBST清洗膜條3次。在含5%脫脂牛奶的TBST中按1∶5 000稀釋二抗，將膜條置于二抗中室溫孵育1.5 h。用TBST充分清洗，加入ECL發(fā)光顯色液，成像拍照。

1.2.5 銅親和樹脂蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn):配制結(jié)合液(含20 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液)、清洗液(含100 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液)和洗脫液(含50 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液)。將Ni NTA親和樹脂從保存液中吸出，2 000 r/min離心3 min后，棄上清，加入結(jié)合液置于風(fēng)車上旋轉(zhuǎn)清洗，每次5 min。離心棄上清，用洗脫液清洗樹脂兩次，每次5 min。用洗脫液清洗樹脂過夜。用結(jié)合液洗樹脂3次，每次5 min。用ddH2O洗樹脂3次，每次5 min，得到不含金屬離子的空白樹脂。取空白樹脂用0.1 mol/L CuSO4溶液孵育1 h，使樹脂與銅充分結(jié)合。用ddH2O洗樹脂3次。將100 μL樹脂(其中樹脂約50 μL)從保存液中吸出，每管用1 mL ddH2O洗樹脂1次，清洗5 min。用1 mL 結(jié)合液洗樹脂3次，每次5 min。取WT、Ctr1-/-和2.5 μmol/L TTM處理48 h的3組H9c2細(xì)胞，用非變性的方法提取細(xì)胞蛋白。蛋白質(zhì)提取后，放入超聲破碎儀中適當(dāng)超聲。將蛋白質(zhì)放入冷凍離心機(jī)中12 000 r/min離心2 min，取上清于新管。使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，取蛋白質(zhì)總量為500 μg的蛋白質(zhì)溶液，分別與含銅和不含銅的樹脂4 ℃孵育過夜。離心后，棄掉上層液體。每管用1 mL 清洗液洗3次，每次5 min。加入適量的結(jié)合液與SDS上樣緩沖液，充分混勻，沸水浴10 min。4 ℃離心12 000 r/min 2 min，取上層蛋白質(zhì)，棄去下方樹脂。將蛋白質(zhì)溶液送往華大基因公司進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建Ctr1敲除的H9c2細(xì)胞株

使用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向大鼠Ctr1的2號(hào)外顯子，成功構(gòu)建Ctr1敲除(Ctr1-/-)的H9c2細(xì)胞株，細(xì)胞中Ctr1表達(dá)水平降低(P<0.01)，CTR1蛋白表達(dá)水平降低，銅含量下降(P<0.05)(圖1)。

A.schematic diagram of sgRNA design targeting Ctr1 gene in H9c2 cells; B.genome sequencing results of Ctr1 knockout H9c2 cell strain; C.relative expression level of Ctr1 gene in Ctr1-/- H9c2 n=3); D.protein expression level of CTR1 in Ctr1-/- H9c2 cells；E.copper level Ctr1-/- H9c2 cells n=3)，**P<0.01, *P<0.05 compared with WT(wildtype)

2.2 篩選出能與銅結(jié)合的去泛素化酶OTUB1

野生型(wildtype,WT)、Ctr1-/-以及銅螯合劑TTM處理的細(xì)胞總蛋白經(jīng)銅親和樹脂pull down后共同富集到130個(gè)蛋白，富集到的蛋白基因功能與信號(hào)通路與泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)密切相關(guān)，去泛素化酶卵巢腫瘤(ovarian tumor,OTU)相關(guān)蛋白1(OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding proteins 1, OTUB1)可能是與銅結(jié)合的酶。Western blot實(shí)驗(yàn)證明，OTUB1能夠與銅結(jié)合(圖2)。

2.3 銅缺乏的細(xì)胞中泛素化水平升高

Ctr1-/-細(xì)胞中，K48多聚泛素化水平升高，K63多聚泛素化水平降低，總體泛素化水平升高。H9c2細(xì)胞經(jīng)2.5 μmol/L TTM處理后，隨著時(shí)間的推移，總體泛素化水平升高(圖3)。

2.4 銅缺乏的細(xì)胞中OTUB1功能受到抑制

在Ctr1-/-細(xì)胞和經(jīng)2.5 μmol/L TTM處理48 h的細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，OTUB1的靶蛋白DEPTOR(一種mTOR抑制分子)蛋白水平下降，mTOR激活(圖4)。

3 討論

心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。Ca2+傳遞異常、線粒體功能缺失、氧化應(yīng)激、蛋白合成降解異常等病理刺激，均可以觸發(fā)下游廣泛的信號(hào)通路促進(jìn)心臟重構(gòu)和功能障礙，導(dǎo)致病理性心肌肥厚及心力衰竭的發(fā)生[7]。UPS是細(xì)胞內(nèi)控制蛋白降解的重要途徑。泛素是一個(gè)由76個(gè)氨基酸組成的蛋白，可被泛素激活酶E1激活，與泛素結(jié)合酶E2相連，隨后被運(yùn)送至泛素連接酶E3與靶蛋白結(jié)合，而去泛素化酶DUB則與E3相反，可去除靶蛋白上的泛素。最后多泛素化蛋白被募集到26S蛋白酶體，消耗能量進(jìn)行泛素依賴性的蛋白水解，降解底物蛋白[8]。由于蛋白質(zhì)降解的缺陷，錯(cuò)誤折疊或受損的異常蛋白質(zhì)在細(xì)胞中積累，正常蛋白質(zhì)過度降解而失去功能，均可以成為心血管疾病的誘因[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，小鼠體內(nèi)，心臟缺乏去泛素化酶OTUB1發(fā)生心肌肥厚和心力衰竭，導(dǎo)致小鼠過早死亡[10]。其分子機(jī)制為，OTUB1的缺失促進(jìn)了mTOR抑制性調(diào)節(jié)因子DEPTOR的降解，導(dǎo)致細(xì)胞中mTOR信號(hào)通路的激活[10-11]。

A.Venn diagram analysis of copper-binding proteins in three groups of cells (WT, Ctr1-/- and TTM); B.GO enrichment analysis of enriched copper-binding proteins; C.KEGG pathway analysis of enriched copper-binding proteins; D.a list of copper-binding proteins involved in UPS; E.copper-binding capacity of the deubiquitinase OTUB1

A.K48-linkage polyubiquitin levels in WT and Ctr1-/- H9c2 cells; B.K63-linkage polyubiquitin levels in WT and Ctr1-/- H9c2 cells; C.total ubiquitin levels in WT and Ctr1-/- H9c2 cells; D.ubiquitin levels over time after H9c2 cells were treated with 2.5 μmol/L TTM from 0 hour to 48 hours

圖4 銅缺乏的細(xì)胞中OTUB1功能受到抑制Fig 4 OTUB1 function was inhibited in copper-deficient cells

以往對(duì)缺銅導(dǎo)致的心肌肥厚僅從線粒體功能缺失、Ca2+傳遞異常角度考慮[6]。本文構(gòu)建了銅缺乏的H9c2細(xì)胞模型，并通過銅親和樹脂質(zhì)譜聯(lián)合鑒定出能夠與銅結(jié)合的UPS系統(tǒng)中重要的酶OTUB1。在銅缺乏的細(xì)胞中，K48多聚泛素化水平和總泛素化水平升高，與文獻(xiàn)報(bào)道的OTUB1特性一致[12-13]；類似地，在缺銅條件下，OTUB1蛋白表達(dá)水平無明顯變化，然而其下游DEPTOR水平下降，mTOR信號(hào)通路被激活，證明缺銅條件下，OTUB1的活性降低。

本文首次證明，銅能夠與去泛素化酶OTUB1結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性，參與蛋白質(zhì)降解途徑的調(diào)控，這一結(jié)果揭示了銅在生命活動(dòng)中扮演的新角色，使人們對(duì)銅的生物學(xué)功能有了更深入的理解；此外，本文發(fā)現(xiàn)OTUB1參與銅缺乏導(dǎo)致的心肌肥厚發(fā)生，為臨床上治療由銅缺乏如門克斯病(Menkes disease)導(dǎo)致的心血管疾病以及其他疾病提供了新的思路。不足的是，本文僅在細(xì)胞模型水平進(jìn)行驗(yàn)證，且銅與OTUB1結(jié)合的具體機(jī)制尚未充分研究。研究小組未來將進(jìn)一步在模型動(dòng)物中驗(yàn)證該機(jī)制，并研究銅與OTUB1具體結(jié)合的位點(diǎn)。