過(guò)表達(dá)miR-150的腎小管上皮細(xì)胞系HK-2中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜

郝相楠，欒軍軍，馬 聰，張旖驍，周 華*

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1.腎內(nèi)科； 2.泌尿外科， 遼寧 沈陽(yáng) 110004)

微小RNA(microRNA, miRNA)是一種由約22個(gè)核苷酸組成的短小，單鏈，非編碼RNA[1]，幾乎參與所有細(xì)胞進(jìn)程，對(duì)于動(dòng)物發(fā)育，細(xì)胞分化和體內(nèi)平衡至關(guān)重要[2]。既往對(duì)miR-150的研究表明，miR-150的過(guò)表達(dá)顯著降低了腎小管上皮細(xì)胞系HK-2中抗纖維化蛋白抑制因子細(xì)胞因子信號(hào)1(suppressor of cytokine signal 1, SOCS1)的表達(dá)并上調(diào)了促纖維蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了腎臟纖維化[3-4]。在HK-2細(xì)胞中，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)增加了miR-150的表達(dá)，降低了SOCS1的表達(dá)[5]。以上充分證明miR-150在腎小管疾病中的重要作用和繼續(xù)深入研究其相關(guān)效應(yīng)的必要性。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，雖不編碼任何蛋白質(zhì)，但lncRNA可以通過(guò)順式和反式作用機(jī)制和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來(lái)改變蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，包括印記和其他類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，充當(dāng)分子海綿等在基因表達(dá)的調(diào)控中起著重要作用[6]。微小RNA(miRNA)可以與其靶向mRNA相互作用以使mRNA被驅(qū)動(dòng)降解[7]，lncRNA可以通過(guò)阻止miRNA與其靶向mRNA相互作用而抑制這些過(guò)程，從而促進(jìn)mRNA穩(wěn)定并誘導(dǎo)基因表達(dá)，逐漸成為mRNA穩(wěn)定性和衰變的重要調(diào)節(jié)劑[8]。因此，lncRNA在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[9]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)miR-150過(guò)表達(dá)的HK-2細(xì)胞中差異表達(dá)的lncRNA，篩選出與miR-150表達(dá)相關(guān)的lncRNA，探究miR-150能通過(guò)哪些lncRNA的表達(dá)從而產(chǎn)生效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人腎小管上皮細(xì)胞系HK-2(ATCC),復(fù)蘇后接種于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的F12 培養(yǎng)液中，在含有5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞增殖到80%匯合時(shí)進(jìn)行傳代，培養(yǎng)皿的接種濃度為1.0×105個(gè)/mL的細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后做相應(yīng)處理。

1.1.2 試劑：胎牛血清、青鏈霉素、DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、非必需氨基酸、Lipofectamine 3000(Lipo3000)(Invitrogen公司); DMSO(Sigma-Aldrich公司); 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR相關(guān)試劑 (TaKaRa公司); p-JAK2、JAK-2、p-STAT1、STAT1、p-STAT3、STAT3、COL-1、GAPDH抗體(Cell Signaling Technology公司); miR-150及內(nèi)參引物序列由廣州銳博生物科技公司設(shè)計(jì)并合成，miR-150上游引物5′-GGGTCTCCCAACCCTTGTA-3′，下游5′-ATCCAG TGCAGGGTCCGAGG-3′； 以U6為miR-150的測(cè)定內(nèi)參，上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA AAT-3′，下游5′-TTCACGAATTTGCGTGTCATC-3′。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：轉(zhuǎn)染之前按正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)，細(xì)胞增殖匯合度至70%前1 h更換培養(yǎng)液，然后用250 μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋7.5 μL Lipo3000；再將Lipo3000稀釋液與miR-150 mimic或陰性對(duì)照稀釋液1∶1混合，室溫孵育10 min；然后將250 μL轉(zhuǎn)染液加入到加過(guò)培養(yǎng)基的3.5 cm培養(yǎng)皿中，在常規(guī)CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。

1.2.2 差異性lncRNA表達(dá)譜的鑒定：經(jīng)過(guò)Illumina NovaSeq 6000測(cè)序儀測(cè)序，收獲雙端讀長(zhǎng)(reads)。利用Q30進(jìn)行質(zhì)控，使用cutadapt軟件(v1.9.3)去除接頭和低質(zhì)量讀長(zhǎng)，獲得高質(zhì)量讀長(zhǎng)，分析lncRNA的結(jié)果。使用 hisat2軟件(v2.1)，將高質(zhì)量reads比對(duì)到人類(lèi)參考基因組(UCSC HG19)上。然后，在gtf基因注釋文件指導(dǎo)下，使用cuffdiff軟件獲得轉(zhuǎn)錄本水平lncRNA的FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)值，作為lncRNA的表達(dá)譜，并計(jì)算兩個(gè)/組樣品間的倍數(shù)變化和p-value 以篩選差異表達(dá)lncRNA。根據(jù)臨近關(guān)系，預(yù)測(cè)lncRNA的靶基因，進(jìn)行靶基因的GO和KEGG通路分析。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)miR-150的相對(duì)表達(dá)量：用Trizol法提取HK-2細(xì)胞中總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cRNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，以U6作為內(nèi)參，計(jì)算miR-150相對(duì)表達(dá)量(圖4A)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)：使用全蛋白質(zhì)提取試劑盒提取蛋白質(zhì)并且用BCA法測(cè)濃度。取出等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot，首先進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂奶粉室溫于搖床封閉PVDF膜2 h，TBST洗凈奶粉后加入一抗，4 ℃搖床過(guò)夜，回收一抗后用TBST洗凈，將PVDF膜在室溫下與二抗在室溫?fù)u床孵育1 h，再用TBST洗凈二抗，使用Tanon 5500成像系統(tǒng)拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)miR-150的HK-2細(xì)胞中l(wèi)ncRNAs的分布及特點(diǎn)

在miR-150組和陰性對(duì)照(normal control, NC)組中，lncRNA表達(dá)水平明顯區(qū)分和聚類(lèi)(圖1A, B)。在HK-2細(xì)胞中共檢測(cè)到97 286個(gè)lncRNAs轉(zhuǎn)錄本，其中miR-150組中表達(dá)下調(diào)的lncRNAs 25 858個(gè)，與NC組相比表達(dá)上調(diào)的lncRNAs 71 428個(gè)。LncRNA通過(guò)改變倍數(shù)和P值顯示(倍數(shù)≥1.5且P<0.05)。362個(gè)lncRNAs在miR-150組和NC組中有顯著差異表達(dá)，miR-150組細(xì)胞中有252個(gè)lncRNAs顯著下調(diào)，110個(gè)lncRNAs顯著上調(diào)，差異均為1.5倍以上(圖1C)。在差異表達(dá)的lncRNAs中，大多數(shù)的長(zhǎng)度在500～5 000個(gè)核苷酸(nucleotides，nt)(圖1D)。這些差異表達(dá)的lncRNAs位于人類(lèi)所有染色體上，包括22個(gè)常染色體和X染色體(X)。線(xiàn)粒體(M)上也分布著一些顯著上調(diào)和下調(diào)的lncRNA(圖1E)。在顯著差異表達(dá)的362個(gè)lncRNAs中，46.1%(167/362)是外顯子同義重疊的lncRNAs，3.8%(14/362)是內(nèi)含子同義重疊的lncRNAs，4.1%(15/362)是內(nèi)含子反義的lncRNAs，10.2%(37/362)是天然反義的lncRNAs，11.0%(40/362)是反向的lncRNAs，24.6%(89/362)是基因間的lncRNAs(圖1F)。

2.2 差異表達(dá)lncRNAs的靶基因功能和通路富集

通過(guò)GO富集分析和KEGG通路富集分析來(lái)預(yù)測(cè)靶基因功能和途徑。GO富集分析包括生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)部分(圖2)。

KEGG富集分析顯示,低表達(dá)lncRNA靶基因主要參與的信號(hào)通路包括自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、麻疹、胰島素抵抗、細(xì)胞凋亡、抗原處理和呈遞、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路(圖3A)；高表達(dá)lncRNA靶基因主要參與的信號(hào)通路包括泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、泛醌和其他萜醌生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、p53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路、DNA復(fù)制(圖3B)。

2.3 miR-150-lncRNA-JAK2-STAT1/3-COL1通路驗(yàn)證

miR-150模擬物轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，HK-2細(xì)胞中miR-150的表達(dá)明顯升高(圖4A)，下調(diào)最顯著的前5個(gè)lncRNAs為APOL6、UBL7、MVB12A、APOL1、NUDT14(圖4B)，miR-150組的p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、COL-1表達(dá)均上調(diào)(圖4C)。

3 討論

微小RNA的失調(diào)可以導(dǎo)致生物學(xué)功能的改變，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生與發(fā)展[10]。既往研究表明，miR-150的過(guò)表達(dá)顯著降低了腎小管上皮細(xì)胞系HK-2中SOCS1的表達(dá)并上調(diào)了促纖維蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了腎臟纖維化[3-4]。在HK-2細(xì)胞中，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)增加了miR-150的表達(dá)，降低了SOCS1的表達(dá)[5]。以上充分證明miR-150在腎臟纖維化中的重要作用和繼續(xù)深入研究其相關(guān)效應(yīng)的必要性。但是關(guān)于miR-150能否調(diào)控lncRNA，目前尚無(wú)報(bào)道。

LncRNA雖不編碼任何蛋白質(zhì)，但在基因印跡、分化和發(fā)育、抗病毒反應(yīng)等許多細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[6]。既往研究多數(shù)探究的是lncRNA對(duì)miR-150的影響，如lncRNA-HULC作為miR-150-5p的海綿，通過(guò)調(diào)節(jié)miR-150-5p對(duì)伊馬替尼的抗性起到了促進(jìn)作用[11]；在系統(tǒng)性青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎中，lncRNA-MALAT1表達(dá)的下調(diào)通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路調(diào)節(jié)miR-150-5p/ZBTB4軸減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[12]；LncRNA ZFAS1通過(guò)“海綿”作用于miR-150-5p，從而增加Notch3的表達(dá)[13]；LncRNA-PRLB的敲除部分地通過(guò)靶向miR-150-5p抑制RSF1/NF-κB信號(hào)的激活而提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性[14]；LncRNA-NEAT1通過(guò)miR-150-5p/CPSF4軸調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌中5-氟尿嘧啶敏感性、細(xì)胞凋亡和侵襲[15]。而本研究探索了miR-150表達(dá)的改變對(duì)各種lncRNAs的表達(dá)產(chǎn)生影響，探求miR-150通過(guò)反向作用于lncRNA對(duì)腎臟生理病理過(guò)程可能發(fā)揮的作用。

A.each column represented kidney tissue, each row represented lncRNA identified by lncRNA sequencing, green represented down regulated lncRNA, and red represented up regulated lncRNA;B.volcano map showed the differential expression of lncRNA between miR-150 group and negative control group, the vertical line changes upward or downward by 2 times (log2 scaled); The horizontal line represented a P value of 0.05 (log10 scaled), the red dot showed that the differential expression of lncRNA was statistically significant; C.compared with the negative control group, there were 362 lncRNAs in miR-150 group, showing a significant difference of expression more than 1.5 times(P< 0.05),110 lncRNAs were up-regulated and 252 lncRNAs were down regulated; D.distribution of differentially expressed lncRNA based on the length of nucleic acid; E.distribution of differentially expressed lncRNAs based on the location of human chromosomes; F.distribution of differentially expressed lncRNAs based on the relationship between lncRNA and its coding genes

Through Gene Oncology (GO) analysis, the top 10 predictive functions of 252 low expression (A, C, E) and 110 high expression (B, D, F) lncRNAs regulated host genes in miR-150 group were obtained.They were classified according to biological processes (A, B), cellular components (C, D) and molecular functions (E, F)

通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在miR-150過(guò)表達(dá)組中有362個(gè)顯著差異表達(dá)的lncRNAs，提示miR-150可通過(guò)lncRNAs參與腎臟纖維化的發(fā)生，進(jìn)一步在顯著下調(diào)的lncRNAs中進(jìn)行生物分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)lncRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)模式，驅(qū)動(dòng)主要的細(xì)胞過(guò)程，而這些對(duì)于HK-2細(xì)胞/或腎臟的生理和病理過(guò)程至關(guān)重要。本研究主要對(duì)miR-150-lncRNA-JAK2-STAT1/3-COL1通路進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)miR-150的確能夠通過(guò)lncRNA-JAK2-STAT1/3-COL1通路參與腎臟纖維化。

A.enrichment results of KEGG pathway with low expression of lncRNAs; B.enrichment results of KEGG pathway with high expression of lncRNAs

NC.normal control; A.transfection of HK-2 cells with miR-150 mimics; B.downregulation of the first five lncRNAs;C.Western blot of miR-150-lncRNA-JAK2-STAT1/3-COL1； *P<0.05 compared with NC group

綜上，本研究通過(guò)對(duì)miR-150過(guò)表達(dá)和陰性對(duì)照的腎小管上皮細(xì)胞系HK-2進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示兩組細(xì)胞中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)存在顯著差異；而其中受miR-150影響的部分lncRNAs可能參與各種生物過(guò)程及通路的調(diào)控。由于lncRNAs 具有較高的組織特異性，進(jìn)一步分析這些lncRNAs或可為通過(guò)miR-150治療各種腎小管疾病的研究及靶向治療提供新思路。