miR-146a-5p對(duì)炎癥反應(yīng)因子及脂代謝因子的調(diào)節(jié)作用

孫雅楠 李斯 尹明潔 (唐山市工人醫(yī)院 內(nèi)分泌二科，河北 唐山 063000；心內(nèi)四科)

2型糖尿病(T2DM)目前被認(rèn)為是一種慢性低度炎癥反應(yīng)，主要由于營養(yǎng)物質(zhì)堆積所觸發(fā)的肝臟、胰腺等組織細(xì)胞的炎癥反應(yīng)〔1,2〕，能夠?qū)е缕咸烟羌爸|(zhì)代謝紊亂并降低機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性。研究顯示T2DM患者機(jī)體脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6等炎癥因子水平較健康人群顯著升高〔3～5〕。miR-146a-5p基因位于人第5號(hào)染色體，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)功能的miRNA，研究顯示在T2DM患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a-5p表達(dá)水平顯著降低，并且miR-146a-5p能夠通過炎癥誘導(dǎo)調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞凋亡〔6,7〕，在牙齦卟啉單胞菌(P.g)LPS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞炎性反應(yīng)時(shí)，miR-146a-5p表達(dá)量增加是否對(duì)細(xì)胞中白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶(IRAK)-1、膽固醇代謝相關(guān)因子ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC)G1蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生影響，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以HepG2細(xì)胞為研究模型，分別以P.gLPS刺激、miR-146a-5p-mimics轉(zhuǎn)染為干預(yù)手段，探討在細(xì)胞炎癥反應(yīng)狀態(tài)下miR-146a-5p對(duì)炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)代謝因子的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 HepG2細(xì)胞系由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為4組：HepG2細(xì)胞體外P.gLPS刺激為P.gLPS刺激組；HepG2細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染miR-146a-5p-mimics為miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組；He-pG2細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染miR-146a-5p-mimics后經(jīng)P.gLPS刺激為miR-146a-5p轉(zhuǎn)染+P.gLPS刺激組；陰性對(duì)照組未經(jīng)P.gLPS刺激未轉(zhuǎn)染miR-146a-5p-mimics，其他培養(yǎng)條件與各組相同。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇后的HepG2細(xì)胞加入適量含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成105/ml濃度移至培養(yǎng)瓶中，置于37%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿瓶壁即可傳代。

1.4細(xì)胞刺激與轉(zhuǎn)染 P.gLPS刺激：P.gLPS刺激組與miR-146a-5p轉(zhuǎn)染+P.gLPS刺激組分別加入P.gLPS的濃度為1 μg/ml，培養(yǎng)6 h收獲細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。miR-146a-5p-mimics轉(zhuǎn)染：將配制好的miR-146a-5p-mimics轉(zhuǎn)染復(fù)合物250 μl，加入培養(yǎng)好的HepG2孔板中，再吸取Opti-MEM培養(yǎng)基750 μl/孔，加入各孔中，前后輕柔搖動(dòng)細(xì)胞板至混合均勻。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于 37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染6 h后吸取1 ml普通DMEM培養(yǎng)基(含有20%胎牛血清、無抗生素)，加入各孔。

1.5Western印跡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后應(yīng)用放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解獲得細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度，之后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳過后取目的蛋白條帶恒流200 mA，轉(zhuǎn)膜1 h。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜用TBST水洗，放入封閉液中，在搖床上封閉1 h。按1∶100或1∶200的比例配制一抗體與一抗稀釋液，將封閉好的膜放入配好的一抗稀釋液，4℃搖床過夜。按1∶1 000或1∶2 000的比例配制二抗與二抗稀釋液，將膜放入配好的二抗稀釋液，常溫?fù)u床上搖3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加顯色液在凝膠成像系統(tǒng)顯色，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度 應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算每管蛋白的吸光度，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取3 μl待測(cè)蛋白液，加入100 μl考馬斯亮藍(lán)顯色液，用分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算出吸光度值，計(jì)算出待測(cè)蛋白的濃度。

1.7轉(zhuǎn)膜及染色 電泳分離蛋白分子，轉(zhuǎn)膜，將膜放入封閉液中，在搖床上封閉1 h。加一抗，4℃搖床過夜。加二抗，常溫?fù)u床上搖3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加顯色液在凝膠成像系統(tǒng)顯色，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。GraphPAD Prism5.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié) 果

P.g LPS刺激組IRAK-1蛋白水平(1.16±0.12)顯著高于陰性對(duì)照組(0.73±0.89，P<0.05)。miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組IRAK-1蛋白水平(0.52±0.32)顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.05)。miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組ABCG1蛋白水平(0.47±0.05)與陰性對(duì)照組相比未見明顯變化(P>0.05)。miR-146a-5p轉(zhuǎn)染+P.gLPS刺激組IRAK-1蛋白水平(0.66±0.04)顯著低于P.gLPS刺激組(P<0.01)。P.gLPS刺激組ABCG1蛋白水平(0.67±0.03)顯著高于陰性對(duì)照組(0.51±0.12，P<0.05)。miR-146a-5p轉(zhuǎn)染+P.gLPS刺激組ABCG1蛋白水平(0.43±0.02)顯著低于P.g LPS刺激組(P<0.01)。見圖1。

1～4：陰性對(duì)照組、miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組、P.g LPS刺激組、miR-146a-5p轉(zhuǎn)染+P.gLPS刺激組圖1 miR-146a-5p拮抗P.gLPS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞IRAK-1、ABCG1上調(diào)

3 討 論

T2DM作為一種機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)，以胰島素抵抗、血糖水平升高、脂代謝紊亂為主要特征，目前研究顯示T2DM患者機(jī)體炎性因子如：LPS、腫瘤壞死因子-α水平顯著升高，并且升高的炎性因子及其下游級(jí)聯(lián)的炎性反應(yīng)將會(huì)降低機(jī)體胰島素敏感性〔8，9〕。當(dāng)敲除大鼠炎癥因子Toll樣受體(TLR)-4基因后，能夠增加大鼠肝臟胰島素敏感性，降低炎性反應(yīng)，改善肝臟脂肪變性〔10〕。說明降低機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)將有利于恢復(fù)機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性及有利于機(jī)體脂質(zhì)代謝。

miR-146a-5p作為具有免疫調(diào)節(jié)功能的miRNA，研究顯示其具有促進(jìn)炎癥修復(fù)，抑制慢性炎癥反應(yīng)的作用〔11，12〕。研究證實(shí)miR-146a-5p在T2DM患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中及T2DM大血管并發(fā)癥患者血漿中表達(dá)均顯著降低〔6，7〕。并且在T2DM合并腦卒中患者中檢測(cè)到血小板和血漿miR-146a-5p水平明顯下調(diào)，這種下調(diào)可能級(jí)聯(lián)誘導(dǎo)血小板激活，在中國T2DM患者中miR-146a-5p表達(dá)水平降低是缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素〔13〕。本研究結(jié)果說明在細(xì)胞炎性反應(yīng)時(shí)miR-146a-5p通過下調(diào)IRAK-1發(fā)揮抑制炎癥、防止炎癥反應(yīng)放大的作用。miR-146a-5p具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的功能，抑制IRAK-1表達(dá)是其發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用途徑之一。如：應(yīng)用LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，檢測(cè)到炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β等炎癥因子表達(dá)水平均升高，予以miR-146a-5p干預(yù)后其通過顯著下調(diào)IRAK-1發(fā)揮抑制炎性因子表達(dá)的作用〔14〕，還有研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子刺激可誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞和人類胰島細(xì)胞miR-146a表達(dá)水平升高，miR-146a進(jìn)一步通過下調(diào)IRAK-1發(fā)揮抑制炎癥作用〔15〕，本研究結(jié)果證實(shí)miR-146a-5p在調(diào)整細(xì)胞炎癥反應(yīng)等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。

ABCG1在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的初始階段發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇外流的作用，起到清除組織細(xì)胞內(nèi)多余膽固醇的作用〔16，17〕。LPS可以誘導(dǎo)腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并抑制目標(biāo)基因ABCG1的表達(dá)〔18，19〕。LPS炎性刺激小鼠BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞，顯著下調(diào)ABCG1 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)〔20〕。本研究結(jié)果說明在細(xì)胞炎性反應(yīng)時(shí)miR-146a-5p能夠顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞ABCG1蛋白水平。研究顯示，許多miRNA可以通過上調(diào)或下調(diào)ABCG1表達(dá)水平參與機(jī)體膽固醇代謝〔21〕，本研究顯示miR-146a-5p能夠負(fù)向調(diào)節(jié)致炎因子P.gLPS介導(dǎo)的膽固醇代謝過程。

綜上，miR-146a-5p具有抑制炎癥因子及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的功能，為進(jìn)一步研究慢性炎癥所引起的病理及生理變化奠定基礎(chǔ)。