RNAi PRRX1基因表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲、遷移、EMT及STAT3信號的影響

汪海峽 楊法鏡 王立成

(1浙江大學(xué)舟山醫(yī)院胃腸外科，浙江 舟山 316000；2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科)

結(jié)直腸癌是常見的消化道腫瘤之一，惡性程度較高，近些年我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移是引起結(jié)直腸癌死亡的一個主要原因〔1〕。近些年的大量研究證實(shí)，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是決定腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個關(guān)鍵因素〔2〕。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)移激活因子(STAT)3是STATs家族成員之一，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、分化等過程中發(fā)揮重要作用，在結(jié)直腸癌、肺癌等多種腫瘤中異?；罨?，4〕。腸癌中異?；罨腟TAT3信號可促進(jìn)EMT〔5〕。配對相關(guān)同源框蛋白(PRRX)1基因定位于細(xì)胞核1q24.2，屬于配對同源框家族，近年來PRRX1在腫瘤中的作用受到越來越多的關(guān)注〔6〕。結(jié)直腸癌中PRRX1的研究較少。有研究顯示，miR-124可通過直接靶向抑制PRRX1增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的輻射敏感性〔7〕。PRRX1可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的EMT，其表達(dá)與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)〔8〕。本研究擬采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)將PRRX1的小干擾RNA瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞，旨在PRRX1表達(dá)抑制對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響，并進(jìn)一步研究其對EMT過程及STAT3信號的調(diào)控作用。

1 材料方法

1.1細(xì)胞株 正常結(jié)腸NCM460細(xì)胞及結(jié)直腸癌LoVo、SW620、HT29細(xì)胞均購自美國ATCC。細(xì)胞在含10%胎牛血清 (FBS)的DMEM培養(yǎng)基中，于5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。

1.2試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、FBS(美國Gibco)；PRRX1、E-鈣黏蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、STAT3、p-STAT3和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2一抗及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗(美國CST)；噻唑藍(lán)(MTT；美國Sigma)；Transwell小室試劑盒(美國Corning)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國BD)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad)。

1.3轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分組：空白組、陰性組和干擾組。陰性組和干擾組分別轉(zhuǎn)染設(shè)計合成(上海吉瑪完成)的陰性對照siRNA及PRRX1的特異性siRNA。以2×105/孔接種生長至對數(shù)期的LoVo細(xì)胞于6孔板，每孔2 ml，細(xì)胞達(dá)70%生長融合時，參照LipofectamineTM2000說明(美國Invitrogen)制備siRNA-Lip2000復(fù)合物，將復(fù)合物加至6孔板，混勻，空白組僅加入脂質(zhì)體，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育4～6 h，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4PRRX1蛋白表達(dá)檢測 適量細(xì)胞裂解液提取轉(zhuǎn)染siRNA 48 h的細(xì)胞總蛋白，BCA測定細(xì)胞蛋白濃度，蛋白樣品與5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液混勻，于100℃沸水中變性5 min，取變性蛋白上樣(30 μg)，經(jīng)10% SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)移分離后的蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)封閉1 h，加按照1∶500和1∶1 000稀釋的PRRX1抗體和內(nèi)參GAPDH抗體，4℃孵育過夜，加HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯影。ImageJ軟件分析條帶灰度值。以PRRX1與GAPDH條帶灰度值比值為PRRX1的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞活力檢測 以5×103/孔接種生長至對數(shù)期的LoVo細(xì)胞于96孔板，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)孵育24 h以進(jìn)行同步化處理，按照1.3分組將siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每組5個復(fù)孔，于轉(zhuǎn)染的24、48、72、96 h收集細(xì)胞，每孔加5 mg/ml的MTT 20 μl，37℃孵育4 h，棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，加150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，室溫孵育10 min，微振蕩器震蕩10 min以使結(jié)晶能溶解充分，利用空白對照孔調(diào)零，酶標(biāo)儀測定570 nm的吸光度值(A)。各組取5個孔的均值，繪制增殖曲線。

1.6細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell法。無血清培養(yǎng)液與基質(zhì)膠按照1∶3比例混勻，混合液包被Transwell小室上室，于37℃孵箱中孵育4～5 h以使其能凝結(jié)成膠狀。無血清的培養(yǎng)液洗轉(zhuǎn)染siRNA 48 h的細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/ml，Transwell小室上室中加入細(xì)胞懸液200 μl(1×105個/孔)，Transwell小室下室中加入500 μl含10% FBS的培養(yǎng)液，37℃孵箱中常規(guī)孵育24 h。取出小室，輕輕拭掉小室底層膜和未穿膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，倒置顯微鏡高倍視野下(×200)隨機(jī)選擇5個視野，計數(shù)侵襲至濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)，取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞遷移能力檢測 方法同1.6，不同之處是Transwell小室上室未鋪基質(zhì)膠。

1.8E-cadherin、Vimentin、STAT3、p-STAT3和MMP-2蛋白表達(dá)檢測 方法同1.4。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PRRX1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá) LoVo(0.585±0.063)、SW620(0.412±0.039)和HT29(0.391±0.040) 3株結(jié)直腸癌細(xì)胞株中PRRX1蛋白表達(dá)均顯著高于正常結(jié)腸NCM460細(xì)胞(0.034±0.006，P<0.05)。見圖1。

圖1 PRRX1在結(jié)直腸癌細(xì)胞表達(dá)

2.2PRRX1在轉(zhuǎn)染PRRX1 siRNA的LoVo細(xì)胞中的表達(dá) 干擾組PRRX1蛋白表達(dá)(0.067±0.009)顯著低于空白組(0.452±0.038，P<0.05)，而陰性組PRRX1蛋白表達(dá)(0.469±0.041)與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 PRRX1在轉(zhuǎn)染PRRX1 siRNA的LoVo細(xì)胞中的表達(dá)

2.3沉默PRRX1表達(dá)抑制LoVo細(xì)胞活力 干擾組在24～96 h的細(xì)胞活力均顯著低于空白組(P<0.05)。見表1。

表1 沉默PRRX1表達(dá)對LoVo細(xì)胞活力的影響

2.4沉默PRRX1表達(dá)抑制LoVo細(xì)胞侵襲和遷移能力 干擾組細(xì)胞侵襲及遷移能力均顯著低于空白組(P<0.05)。見表2。

表2 沉默PRRX1表達(dá)對LoVo細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響個)

2.5沉默PRRX1表達(dá)對EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 干擾組E-cadherin蛋白表達(dá)顯著高于空白組，Vimentin和MMP-2蛋白表達(dá)顯著低于空白組(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 沉默PRRX1表達(dá)對EMT相關(guān)E-cadherin、Vimentin和MMP-2蛋白表達(dá)的影響

表3 各組E-cadherin、Vimentin和MMP-2蛋白表達(dá)比較

2.6沉默PRRX1表達(dá)下調(diào)STAT3信號通路 干擾組p-STAT3蛋白表達(dá)顯著低于空白組(P<0.05)，3組細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4，表4。

圖4 沉默PRRX1表達(dá)對STAT3信號通路的影響

表4 各組STAT3和p-STAT3的蛋白表達(dá)

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，p53依賴的信號通路下調(diào)PRRX1可預(yù)測肝細(xì)胞癌預(yù)后不良〔9〕；沉默PRRX1可通過抑制線粒體膜電位和激活caspase-3凋亡通道，抑制順鉑誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡〔10〕。EMT可促進(jìn)細(xì)胞的遷移、運(yùn)動、分化等，是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵〔11〕。PRRX1可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的EMT，其表達(dá)與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)〔8〕；PRRX1可通過激活Wnt/β-catenin信號促進(jìn)胃癌的EMT，其上調(diào)表達(dá)與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)〔12〕；PRRX1可通過誘導(dǎo)EMT發(fā)生，增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，Wnt信號及NF-κB信號的激活參與了PRRX1調(diào)控的胰腺癌細(xì)胞的EMT〔13〕。以上研究提示沉默PRRX1表達(dá)可通過抑制EMT過程降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

EMT發(fā)生通常有以下幾種特征：上皮細(xì)胞分子標(biāo)記如β-連環(huán)素(catenin)和E-cadherin等表達(dá)減少，間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)記如Vimentin、N-cadherin等表達(dá)增加；MMPs家族成員MMP-2和MMP-9表達(dá)增加；細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化；細(xì)胞失去極性〔14，15〕。本研究結(jié)果顯示，沉默PRRX1表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，下調(diào)Vimentin和MMP-2表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)。E-cadherin表達(dá)降低是EMT中最重要的分子事件。MMPs是一族蛋白水解酶，可控制腫瘤新生血管生成，從而造成腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移〔16〕。MMPs家族中MMP-2與結(jié)直腸癌的關(guān)系最為密切，已有多項研究表明，在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中MMP-2表達(dá)升高，可促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移〔17，18〕。因此，本研究提示PRRX1降低結(jié)直腸癌侵襲遷移的機(jī)制之一是抑制EMT過程。

許多信號通路可誘導(dǎo)EMT，如NF-κB信號、Wnt信號、Notch信號、STAT3信號等〔19〕，STAT3是STATs家族成員之一，在多種腫瘤中都有磷酸化形式的表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔20〕。多種腫瘤中STAT3信號被異常激活，可通過對下游的一些靶基因的調(diào)節(jié)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和凋亡等〔21，22〕。有研究顯示，抑制STAT3信號可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔23〕。本研究結(jié)果提示PRRX1降低結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移能力與下調(diào)STAT3信號有關(guān)。

綜上，沉默PRRX1基因表達(dá)可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力，機(jī)制與抑制EMT過程和下調(diào)STAT3信號有關(guān)。有研究顯示，下調(diào)STAT3信號可通過抑制EMT降低腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力〔24〕。沉默PRRX1表達(dá)是否可通過下調(diào)STAT3信號抑制EMT，本研究還未涉及，因此，后續(xù)研究將進(jìn)一步探討抑制STAT3信號對結(jié)直腸癌侵襲、遷移能力及EMT的影響。