長鏈非編碼RNA MEG3調(diào)控miR-21表達(dá)影響過氧化氫誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

呂守華 宋合保 盧璐祥 馬秋峰 蓋大偉 郝元海 李永濤

(滕州市中心人民醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 滕州 277599)

腦血管疾病是一類常見疾病，其具有死亡率高、致殘率高等特點(diǎn)，腦血管疾病嚴(yán)重威脅人類生命健康〔1〕。氧化應(yīng)激是眾多腦血管疾病發(fā)生的重要原因，研究氧化應(yīng)激條件下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制對腦血管疾病的靶向治療具有重要意義〔2〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)缺乏明顯的開放閱讀框，其長度大于200個(gè)核苷酸，在人類組織中表達(dá)水平不同，參與細(xì)胞分化、生長等過程，LncRNA也是疾病發(fā)生和發(fā)展的重要調(diào)控因子〔3〕。母系表達(dá)基因(MEG)3是目前研究發(fā)現(xiàn)的具有多種生物學(xué)功能的LncRNA，在腫瘤中扮演抑癌基因的作用。研究報(bào)道MEG3還參與腦血管疾病的發(fā)生過程，在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成中發(fā)揮抑制作用，MEG3在腦血管疾病進(jìn)程中可能發(fā)揮促進(jìn)作用〔4〕。MEG3作用機(jī)制較為復(fù)雜，在不同的疾病和生理進(jìn)程中作用機(jī)制可能不同〔5〕。MEG3可以通過調(diào)控miR-21的表達(dá)影響冠心病、腫瘤等進(jìn)展〔6，7〕。miR-21在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，其可抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生〔8〕。本實(shí)驗(yàn)探討MEG3對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響和機(jī)制，為明確腦血管疾病發(fā)生機(jī)制提供參考，為靶向治療腦血管疾病提供思路。

1 材料與方法

1.1材料 人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞購自Sciencell Research Laboratories；引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen；H2O2、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；MEG3 shRNA、shRNA control由漢恒生物技術(shù)(上海)有限公司合成構(gòu)建；酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3和酶切caspase-9抗體購自美國Abcam；miR-21 inhibitor、inhibitor control購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司。

1.2RT-PCR檢測H2O2誘導(dǎo)處理后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中MEG3表達(dá)水平 腦血管內(nèi)皮細(xì)胞分別用0.0和0.1 mmol/L的H2O2細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別命名為Normal組和H2O2組。取培養(yǎng)24 h后兩組細(xì)胞，按照RT-PCR檢測細(xì)胞中MEG3表達(dá)變化，步驟按照每107個(gè)細(xì)胞中添加1 ml的Trizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，吸取1.5 μl的RNA樣品用紫外分光光度計(jì)測定濃度和純度(OD260/OD280比值在1.8～2.0之間)。配制20 μl的逆轉(zhuǎn)錄體系，包括：1 μg的總RNA、1 μl的Anchored-oligo(dT)18 Primer、4 μl的5×RT反應(yīng)緩沖液、0.5 μl的Protector RNase Inhibitor、0.5 μl的Transcriptor Reverse、2 μl的Deoxynucleotide Mix，添加ddH2O至20 μl，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：55℃孵育30 min，85℃孵育5 min，冰上孵育5 min。收集cDNA，保存在-20℃。RT-PCR反應(yīng)體系為：10 μl的SYBR Green Super Mix、2 μl的DNA template、1 μl的的正向和反向引物，添加ddH2O至20 μl。RT-PCR條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，一共40個(gè)循環(huán)。β-actin為參照，根據(jù)反應(yīng)得出Ct值，按照2-△△Ct法計(jì)算MEG3表達(dá)水平。MEG3引物：正義錠：5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′，反義鏈：5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和下調(diào)效果測定 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000試劑說明進(jìn)行，分別把轉(zhuǎn)染shRNA control、MEG3 shRNA后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞用0.1 mmol/L的H2O2細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，依次記為sh-NC+H2O2組和sh-MEG3+H2O2組。收集培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞，RT-PCR測定細(xì)胞中MEG3表達(dá)變化，步驟同上。

1.4流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡 收集培養(yǎng)24 h后各組細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，添加結(jié)合緩沖液500 μl充分混合后，加入Annexin V-FITC和PI染色液各5 μl，放在避光條件下結(jié)合15 min。用流式細(xì)胞儀檢測凋亡變化。

1.5Western印跡測定細(xì)胞中酶切caspase-3、酶切caspase-9蛋白表達(dá) 收集培養(yǎng)24 h后各組細(xì)胞，添加含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解試劑(每107個(gè)細(xì)胞添加1 ml)，在冰上裂解15 min，12 000 r/min高速離心15 min。收集上清，用二喹啉甲酸(BCA)法對蛋白樣品進(jìn)行定量檢測。收集蛋白上清，與5×上樣緩沖液混合，放在100℃加熱5 min。分別配制5%的濃縮膠和12%的分離膠，在濃縮膠中采用70 V電壓電泳，在分離膠中用90 V電壓電泳，觀察預(yù)染的蛋白樣品進(jìn)入到凝膠的下部邊緣后終止電泳。在4℃條件下以220 mA恒流轉(zhuǎn)膜75 min。取出電轉(zhuǎn)以后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，放在含有封閉液(5%牛血清白蛋白)的平皿中，在搖床上孵育2 h。經(jīng)TBST溶液洗滌后，將PVDF膜放在一抗孵育液中，放在4℃環(huán)境中孵育結(jié)合過夜，一抗用封閉液按照1∶1 000稀釋。TBST洗滌，最后把PVDF膜置于1∶3 000稀釋的二抗孵育液中，在室溫中結(jié)合2 h。電化學(xué)發(fā)光(ECL)方法顯色，分析條帶的OD值，以β-actin作為參照，分析目的蛋白表達(dá)變化。

1.6RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-21表達(dá) 收集培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，按照1.2方法檢測細(xì)胞中miR-21的表達(dá)變化，內(nèi)參為U6，miR-21引物為：正向引物：5′-TTGAATTCTAACACCTTCGTGGCTACAGAG-3′,反向引物：5′-TTAGATCTCATTTATCGAGGGAAGGATTG-3′。

1.7miR-21 inhibitor對下調(diào)MEG3影響細(xì)胞凋亡作用 在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染inhibitor control、MEG3 shRNA和miR-21 inhibitor和MEG3 shRNA，并用0.1 mmol/L H2O2細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為sh-MEG3+anti-NC+H2O2組和sh-MEG3+anti-miR-21+H2O2組。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，按照1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡，按照1.5方法檢測酶切caspase-3、酶切caspase-9蛋白表達(dá)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1H2O2誘導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中MEG3表達(dá)上調(diào) H2O2組MEG3水平(2.36±0.25)顯著高于Normal組(1.00±0.09，P<0.05)。表明H2O2誘導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中MEG3表達(dá)上調(diào)。

2.2MEG3 shRNA下調(diào)H2O2處理后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中MEG3表達(dá)水平 sh-MEG3+H2O2組MEG3水平(0.51±0.06)顯著低于sh-NC+H2O2組(0.99±0.12，P<0.05)。表明MEG3 shRNA下調(diào)H2O2處理后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中MEG3表達(dá)水平。

2.3MEG3 shRNA抑制H2O2誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和酶切caspase-3、酶切caspase-9蛋白表達(dá) 與Normal組比較，H2O2組細(xì)胞凋亡率、酶切caspase-3、酶切caspase-9水平均顯著升高(P<0.05)；與sh-NC+H2O2組比較，sh-MEG3+H2O2組細(xì)胞凋亡率、酶切caspase-3、酶切caspase-9蛋白水平均顯著下降(P<0.05)。見圖1、圖2、表1。表明MEG3 shRNA抑制H2O2誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和酶切caspase-3、酶切caspase-9蛋白表達(dá)。

表1 MEG3 shRNA轉(zhuǎn)染后經(jīng)H2O2處理的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率和酶切caspase-3、酶切caspase-9蛋白水平

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測MEG3 shRNA對H2O2處理后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響

1～4：Normal組，H2O2組，sh-NC+H2O2組，sh-MEG3+H2O2組圖2 Western印跡檢測MEG3 shRNA對H2O2處理后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中酶切caspase-3、酶切caspase-9蛋白表達(dá)

2.4MEG3 shRNA上調(diào)H2O2處理的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平 Normal組miR-221水平(1.00±0.09)顯著高于H2O2組(0.45±0.06，P<0.05);sh-NC+H2O2組miR-21水平(0.44±0.03)顯著低于sh-MEG3+H2O2組(0.86±0.07，P<0.05)。表明MEG3 shRNA上調(diào)H2O2處理的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平。

2.5miR-21 inhibitor對MEG3 shRNA影響腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-21表達(dá)的作用 sh-NEG3+anti-NC+H2O2組miR-21水平(1.00±0.11)顯著高于sh-MEG3+anti-miR-21+H2O2組(0.39±0.04，P<0.05)。

2.6下調(diào)miR-21對MEG3 shRNA影響腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用 與sh-MEG3+anti-NC+H2O2組比較，sh-MEG3+anti-miR-21+H2O2組凋亡率、酶切caspase-3、酶切caspase-9均顯著升高(P<0.05)。見圖3、圖4、表2。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-21 inhibitor和MEG3 shRNA共轉(zhuǎn)染后對H2O2條件下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響

1，2：sh-MEG3+anti-NC+H2O2組、sh-MEG3+anti-miR-21+H2O2組圖4 Western印跡檢測miR-21 inhibitor和MEG3 shRNA共轉(zhuǎn)染后對H2O2條件下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中酶切caspase-3、酶切caspase-9蛋白表達(dá)

表2 各組凋亡率和酶切caspase-3、酶切caspase-9水平比較

3 討 論

腦血管疾病的發(fā)生與腦組織中過量的氧自由基引起的氧化應(yīng)激有關(guān)，氧化應(yīng)激條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平增加，血管內(nèi)皮組織受到破壞，進(jìn)而促進(jìn)腦血管損傷〔9〕。H2O2是常用的體外研究腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的誘導(dǎo)因子〔10〕。本研究表明，H2O2處理后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率升高，提示成功構(gòu)建了腦血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。

LncRNA通過支架、誘餌、分子向?qū)У榷喾N方式參與表觀遺傳學(xué)、細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分化、印跡缺失等生理過程〔11〕。研究顯示，LncRNA還與人類疾病有關(guān)，其在腫瘤、組織纖維化、糖尿病并發(fā)癥等多種疾病中扮演關(guān)鍵角色〔12，13〕。MEG3在腎臟、腎上腺、大腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等組織中表達(dá)，與細(xì)胞的生長、組織修復(fù)等有關(guān)〔14〕。研究報(bào)道顯示，MEG3不僅參與腫瘤進(jìn)展，還與心肌梗死、血管生成等密切相關(guān)〔5，6，15〕。MEG3能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，在血管生成中扮演抑制作用，MEG3可能是血管內(nèi)皮損傷的促進(jìn)因子〔4〕。caspase是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白家族，其含有多個(gè)成員，在細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)被激活并形成一個(gè)凋亡級聯(lián)反應(yīng)，caspase蛋白成員只有被活化后才可以發(fā)揮凋亡促進(jìn)的作用〔16〕。caspase-3、caspase-9是caspase蛋白成員，在凋亡級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮起始和凋亡執(zhí)行的作用，其二者活化后形成酶切caspase-3和酶切caspase-9是細(xì)胞凋亡發(fā)生不可逆反應(yīng)的標(biāo)志〔17〕。本研究結(jié)果表明，MEG3在H2O2處理后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而下調(diào)MEG3可抑制H2O2誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和酶切caspase-3、酶切caspase-9蛋白表達(dá)，提示下調(diào)MEG3具有抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。

LncRNA作用十分廣泛，其作用機(jī)制也十分復(fù)雜，LncRNA可以通過影響下游基因的表達(dá)而發(fā)揮不同的生物學(xué)作用〔18，19〕。在腫瘤細(xì)胞中的研究顯示，MEG3可以通過負(fù)調(diào)控miR-21的表達(dá)影響腫瘤惡性進(jìn)展〔5，20〕。MEG3參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生進(jìn)程也與負(fù)調(diào)控miR-21表達(dá)有關(guān)〔21〕。miR-21是一個(gè)具有血管內(nèi)皮保護(hù)作用的miRNA分子，其可以降低血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性，減少細(xì)胞凋亡發(fā)生〔8〕。本研究結(jié)果提示MEG3影響氧化應(yīng)激條件腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程與miR-21有關(guān)。

綜上，MEG3可能是腦血管疾病的促進(jìn)因子，下調(diào)MEG3在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮抑制作用，其作用機(jī)制與負(fù)調(diào)控miR-21的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果為MEG3在腦血管疾病發(fā)生中的作用提供了參考，為靶向治療腦血管內(nèi)皮損傷提供了資料。在以后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)繼續(xù)探討MEG3在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制和對下游信號的調(diào)控作用。