miR-383通過調(diào)控FBXO5表達(dá)抑制人牙周膜細(xì)胞成骨分化和遷移

周俊 原輝婷 余少壯 朱蘭省 (鄭州植得口腔醫(yī)院種植修復(fù)科，河南 鄭州 450000)

牙周病指的是發(fā)生于牙齦、牙周膜等牙齒支持組織的慢性炎癥性疾病，以牙槽骨進(jìn)行性吸收和牙周支持組織破壞為主要特征，而誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞的成骨分化是牙周組織修復(fù)再生的關(guān)鍵因素之一〔1，2〕。基礎(chǔ)治療是診治牙周病的主要手段，但有時(shí)療效不佳，藥物治療成為診治牙周病的必要輔助手段〔3〕；研究牙周膜細(xì)胞的成骨分化機(jī)制，尋找其特異性靶點(diǎn)開發(fā)分子靶向藥物有助于臨床治療牙周病。研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(miRNA)在細(xì)胞分化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，其可靶向結(jié)合目的基因通過上調(diào)或下調(diào)促進(jìn)或抑制成骨分化〔4〕。有研究報(bào)道m(xù)iR-383是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，miR-383在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化過程中下調(diào)，過表達(dá)miR-383抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化，而miR-383的敲低促進(jìn)成骨細(xì)胞分化〔5〕。miR-383還與細(xì)胞的遷移相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)miR-383上調(diào)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲〔6〕。F-box蛋白(FBXO)5是F-box蛋白家族成員之一，微陣列數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析表明，F(xiàn)BXO5的表達(dá)在成骨分化中發(fā)生了很大變化，說明FBXO5可能參與調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化〔7〕。研究報(bào)道在人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs)成骨誘導(dǎo)后，F(xiàn)BXO5的表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)BXO5的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本過表達(dá)促進(jìn)hPDLCs的遷移和成骨分化〔8〕。然而，miR-383對hPDLCs成骨分化和遷移的影響及miR-383是否通過調(diào)控FBXO5影響hPDLCs成骨分化和遷移還尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-383是否通過調(diào)控FBXO5影響hPDLCs成骨分化和遷移。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑 胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基、青/鏈霉素、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；RNA提取試劑盒、熒光定量試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體均購自北京博奧森生物科技有限公司；Transwell小室購于美國BD公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司。miR-con、miR-383、anti-miR-con、anti-miR-383、si-con、si-FBXO5、pcDNA、pcDNA-FBXO5載體質(zhì)粒購自上海斯信生物科技有限公司。Thermo FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1樣本來源 取鄭州植得口腔醫(yī)院門診因正畸拔出的牙，所有供者無傳染疾病，口腔衛(wèi)生良好，近期未有感染，且所有人簽署知情同意書。

1.2.2hPDLCs原代培養(yǎng) 牙齒拔除在超凈工作臺(tái)中用含100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗后，用手術(shù)刀將牙根1/3處牙周膜刮取下來，剪碎后加入Ⅰ型膠原酶消化30 min后加入α-MEM培養(yǎng)液終止反應(yīng)，800 r/min離心5 min后去上清將沉淀物于含10%胎牛血清、100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換1次培養(yǎng)液，約4 d后有細(xì)胞從組織塊中爬出，當(dāng)細(xì)胞融合至80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，后續(xù)試驗(yàn)用第3代hPDLCs。

1.2.3成骨細(xì)胞誘導(dǎo) 取第3代hPDLCs，接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，去除孔內(nèi)培養(yǎng)基，換成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含50 μg/ml抗壞血酸、100 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺、100 nmol/L地塞米松)，每隔3 d換1次培養(yǎng)液，分別收集第0、1、7、14天細(xì)胞備用。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將miR-con、miR-383、anti-miR-con、anti-miR-383、pcDNA、pcDNA-FBXO5分別轉(zhuǎn)染至hPDLCs中，分別記為miR-con組、miR-383組、anti-miR-con組、anti-miR-383組、pcDNA組、pcDNA-FBXO5組；將anti-miR-383分別與si-con、si-FBXO5共轉(zhuǎn)染至hPDLCs中，記為anti-miR-383+si-con組、anti-miR-383+si-FBXO5組；具體轉(zhuǎn)染步驟按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測miR-383和FBXO5 mRNA表達(dá)水平 提取成骨誘導(dǎo)第0、1、7、14天的細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進(jìn)行PCR，miR-383和FBXO5 分別以U6和β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，循環(huán)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。miR-383上游引物序列：5′-CACGAAAGATCAGAAGGTGATTG-3′，下游引物序列：5′-TATCGTTGTTCTCGTCTCCATCTC-3′；U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′；FBXO5 上游引物序列：5′-GCTGTCATATTGGGTCACC-3′，下游引物序列：5′-GTCTACTGGTCT-CTAGTGCTTCT-3′；β-actin上游引物序列：5′-TTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物序列：5′-ACTCATCGTACTCCTGCTTG-3′。

1.2.6Western印跡檢測FBXO5、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX)2、堿性磷酸酶(ALP)、OSX、骨鈣素(OCN)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB抑制蛋白(IκB)α和p-IκBα蛋白表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 90 min后轉(zhuǎn)至PVDF上，用5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h，再分別加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育90 min，PBS洗滌3次，每次5 min，用電化學(xué)(ECL)發(fā)光液顯影，用ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，蛋白相對表達(dá)水平=目的條帶吸光度值/β-actin條帶吸光度值。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.7劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測hPDLCs遷移 劃痕實(shí)驗(yàn)：將第3代hPDLCs按2×104個(gè)/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞單層貼壁后，用200 μl的槍頭在6孔板底部劃出1 mm寬的劃痕，標(biāo)記觀測點(diǎn)，PBS沖洗掉脫落細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、24 h觀察拍照，計(jì)算細(xì)胞生長后兩道劃痕之間相對寬度，并拍照。

Transwell實(shí)驗(yàn)：取200 μl第3代hPDLCs細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室，下室加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后取出小室，吸棄培養(yǎng)液后用棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞，PBS洗滌，用4%多聚甲醛固定30 min，清水洗滌2次，再用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并拍照，計(jì)算結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.8熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)檢測miR-383對FBXO5的靶向調(diào)控 構(gòu)建含有miR-383結(jié)合位點(diǎn)的FBXO5-3′UTR野生型及突變型報(bào)告基因載體，在hPDLCs中轉(zhuǎn)染miR-383 mimics和野生型及突變型報(bào)告基因載體。按照說明書進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1hPDLCs成骨分化誘導(dǎo)過程中miR-383和FBXO5的表達(dá) 與1 d組相比，7 d、14 d組hPDLCs成骨分化誘導(dǎo)過程中miR-383表達(dá)水平顯著降低，F(xiàn)BXO5 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測hPDLCs FBXO5蛋白的表達(dá)

表1 hPDLCs成骨分化誘導(dǎo)過程中miR-383和FBXO5的表達(dá)

2.2干擾miR-383表達(dá)促進(jìn)hPDLCs成骨分化 與anti-miR-con組相比，anti-miR-383組hPDLCs中RUNX2、ALP、OSX和OCN蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖2、表2。表明干擾miR-383表達(dá)促進(jìn)hPDLCs成骨分化。

圖2 Western印跡檢測hPDLCs RUNX2、ALP、OSX和OCN蛋白表達(dá)

表2 干擾miR-383表達(dá)促進(jìn)hPDLCs成骨分化

2.3干擾miR-383表達(dá)促進(jìn)hPDLCs遷移 與anti-miR-con組相比，anti-miR-383組hPDLCs相對寬度顯著降低，細(xì)胞遷移數(shù)顯著升高(P<0.001)。見圖3、圖4、表3。表明干擾miR-383表達(dá)促進(jìn)hPDLCs遷移。

圖3 兩組遷移細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(×100)

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測兩組hPDLCs遷移(結(jié)晶紫染色,×200)

表3 干擾miR-383表達(dá)促進(jìn)hPDLCs遷移

2.4miR-383靶向FBXO5調(diào)控其表達(dá) Targetscan預(yù)測FBXO5與miR-383存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖5。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于miR-con組，miR-383組轉(zhuǎn)染野生型FBXO5表達(dá)載體的hPDLCs熒光素酶活性顯著降低(P<0.001)；而轉(zhuǎn)染突變型FBXO5表達(dá)載體hPDLCs熒光素酶活性差異不顯著(P>0.05)。見表4。相較于miR-con組FBXO5表達(dá)水平(0.58±0.08)，miR-383組(0.37±0.04)顯著降低；相較于anti-miR-con組FBXO5表達(dá)水平(0.61±0.05)，anti-miR-383組(1.17±0.13)顯著升高(P<0.05)，見圖6。表明miR-383可靶向調(diào)控FBXO5的表達(dá)。

圖6 miR-383調(diào)控FBXO5表達(dá)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖5 miR-383與FBXO5互補(bǔ)的核苷酸序列

2.5過表達(dá)FBXO5促進(jìn)hPDLCs遷移和成骨分化 與pcDNA組相比，pcDNA-FBXO5組hPDLCs中FBXO5、RUNX2、ALP、OSX和OCN蛋白水平和細(xì)胞遷移數(shù)顯著升高，細(xì)胞間相對寬度顯著降低(均P<0.001)，見圖7、表5。表明過表達(dá)FBXO5促進(jìn)hPDLCs遷移和成骨分化。

圖7 Western印跡檢測hPDLCs FBXO5、RUNX2、ALP、OSX和OCN蛋白的表達(dá)

表5 過表達(dá)FBXO5促進(jìn)hPDLCs遷移和成骨分化

2.6沉默F(xiàn)BXO5部分逆轉(zhuǎn)anti-miR-383 hPDLCs遷移和成骨分化的促進(jìn)作用 與anti-miR-383+si-con組相比，anti-miR-383+si-FBXO5組hPDLCs FBXO5、RUNX2、ALP、OSX和OCN蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞遷移數(shù)均顯著降低，細(xì)胞間相對寬度顯著升高(均P<0.001)。見表6、圖8。表明沉默F(xiàn)BXO5部分逆轉(zhuǎn)anti-miR-383對hPDLCs遷移和成骨分化的促進(jìn)作用。

表6 沉默F(xiàn)BXO5部分逆轉(zhuǎn)anti-miR-383促進(jìn)hPDLCs遷移和成骨分化

1,2：anti-miR-383+si-con組，anti-miR-383+si-FBXO5組圖8 Western印跡檢測hPDLCs FBXO5、RUNX2、ALP、OSX和OCN蛋白的表達(dá)

2.7miR-383和FBXO5表達(dá)對NF-κB信號(hào)通路的影響 與anti-miR-con組相比，anti-miR-383組hPDLCs中p-IκBα表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-383+si-con組相比，anti-miR-383+si-FBXO5組hPDLCs中p-IκBα表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖9、表7。表明干擾miR-383表達(dá)抑制NF-κB信號(hào)通路，而沉默F(xiàn)BXO5部分逆轉(zhuǎn)干擾miR-383對NF-κB信號(hào)通路的抑制作用。

1～4:anti-miR-con組、anti-miR-383組、anti-miR-383+si-con組、anti-miR-383+si-FBXO5組圖9 Western印跡檢測hPDLCs IκBα和p-IκBα蛋白的表達(dá)

表7 沉默F(xiàn)BXO5和anti-miR-383對hPDLCs IκBα和p-IκBα蛋白的表達(dá)的影響

3 討 論

牙周病是口腔常見病之一，隨著病情的進(jìn)展可能累及牙齦及深層牙周組織，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量〔9〕。hPDLCs能分化成成骨細(xì)胞，參與牙槽骨改建、修復(fù)和牙周再生〔10〕。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)控牙齒發(fā)育和牙再生〔11〕，還影響hPDLCs遷移〔12〕。研究報(bào)道m(xù)iR-383與成骨細(xì)胞分化有關(guān)，過表達(dá)miR-383通過下調(diào)ALP、基質(zhì)礦化、RUNX2和OCN mRNA和蛋白水平來抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化〔5〕。抑制miR-383可通過增加膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)蛋白水平增強(qiáng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療脊髓損傷的治療潛力〔13〕。本研究結(jié)果說明干擾miR-383表達(dá)促進(jìn)hPDLCs遷移。

OCN是骨細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，在骨骼的合成和重建過程中起重要作用，是能反映骨轉(zhuǎn)換過程的特異性標(biāo)志物〔14〕。RUNX2是成骨細(xì)胞分化及牙齒發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白OCN的合成與表達(dá)，參與了正畸牙移動(dòng)中的牙周組織改建〔15〕。ALP是成骨分化活性的重要標(biāo)志物，其活性或表達(dá)水平越高表明成骨分化越明顯〔16〕。OSX是與成骨細(xì)胞分化和骨形成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，lncRNA MALAT1通過靶向人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的miRNA-143促進(jìn)OSX表達(dá)調(diào)節(jié)成骨分化〔17〕。RUNX2、ALP、OCN分別是成骨分化早、中、晚期指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)外成骨分化時(shí)RUNX2、ALP、OCN表達(dá)水平均顯著升高〔18〕。本研究結(jié)果說明干擾miR-383表達(dá)可促進(jìn)hPDLCs成骨分化，提示miR-383可作為治療牙周病的特異性靶點(diǎn)。

FBXO5作為泛素連接酶家族的特異性因子，參與泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解〔19〕。有研究報(bào)道FBXO5的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本過表達(dá)顯著增加hPDLCs遷移，增強(qiáng)ALP活性和礦化，并增加hPDLSC中的RUNX2、OSX和OCN表達(dá)〔8〕。本研究結(jié)果說明過表達(dá)FBXO5可促進(jìn)hPDLCs成骨分化和遷移，表明FBXO5可作為改善牙周組織再生的潛在靶標(biāo)。且本研究提示miR-383可能通過調(diào)控FBXO5的表達(dá)影響hPDLCs遷移和成骨分化。

研究證明NF-κB信號(hào)通路與骨發(fā)育和形成密切相關(guān)，NF-κB參與調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，影響骨的發(fā)育和重塑〔20〕。靜息狀態(tài)下，IκBα與NF-κB結(jié)合，外界刺激后IκBα磷酸化為p-IκBα，解離的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，NF-κB信號(hào)通路激活。有研究報(bào)道腫瘤壞死因子(TNF)-α能激活NF-κB信號(hào)通路，從而抑制hPDLSCs的成骨分化〔21〕。本研究結(jié)果說明干擾miR-383表達(dá)抑制NF-κB信號(hào)通路激活。而沉默F(xiàn)BXO5部分逆轉(zhuǎn)干擾miR-383對NF-κB信號(hào)通路的抑制作用。提示miR-383可能通過FBXO5影響NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞分化。