川芎龍蛭湯對(duì)腦缺血損傷模型大鼠血清中TNF-α、Ang-1和VEGF水平影響及作用機(jī)制

孫錫萍 王念龍 劉天易 祝明浩

(1青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東 即墨 266200；2青島市即墨區(qū)人民醫(yī)院；3山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

腦缺血是腦血管常見疾病，指組織在一定時(shí)間缺血后組織受到損傷，使腦細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)、能量障礙、凋亡基因激活等多種損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷〔1〕。炎癥反應(yīng)可造成腦組織損傷，減少炎癥反應(yīng)可能對(duì)腦缺血損傷疾病的治療及預(yù)后有積極影響，腫瘤壞死因子(TNF)-α具有多種免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白，可介導(dǎo)白細(xì)胞介素(IL)-6等多種炎癥細(xì)胞因子釋放，TNF-α高表達(dá)可加重腦缺血，抑制TNF-α因子合成、分泌及表達(dá)，可減輕缺血再灌注腦損傷〔2，3〕。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)為血管新生過程中調(diào)控因子，也是腦缺血后使血管再生的調(diào)控因子，可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖等促進(jìn)血管新生。血管緊張素(Ang)-1具有強(qiáng)烈促增殖和分化作用，參與內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖等多個(gè)環(huán)節(jié)調(diào)控新生血管，上調(diào)Ang-1表達(dá)可調(diào)控新生血管的重塑〔4，5〕。

腦缺血損傷屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，是嚴(yán)重危害人類生活健康的主要疾病，西醫(yī)臨床治療以溶栓和神經(jīng)保護(hù)劑等為主，不良反應(yīng)較重，成本高，不適合患者長(zhǎng)期使用。中藥有效成分對(duì)各種疾病的預(yù)防和治療具有多環(huán)節(jié)和多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，在減少腦缺血損傷方面也具有一定優(yōu)勢(shì)〔6〕。川芎龍蛭湯為青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院在《壽世保元》卷五活血湯的基礎(chǔ)上，加減化裁形成的院內(nèi)協(xié)定方，對(duì)腦卒中類疾病具有較好的臨床療效，但其作用機(jī)制尚不明確〔7，8〕。本研究探討川芎龍蛭湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血損傷模型大鼠TNF-α、Ang-1和VEGF水平的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，8周齡，體重(200±20)g，購自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔SCXK-(魯)2018-0001〕，室溫飼養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2藥品、試劑及儀器 川芎龍蛭湯方藥組成：川芎10 g、地龍15 g、水蛭10 g、郁金10 g、石菖蒲15 g、膽南星10 g、生黃芪20 g、制首烏15 g、鉤藤10 g、仙靈脾10 g、枸杞子10 g、女貞子10 g、丹參20 g、全蝎10 g、僵蠶10 g。上述中藥飲片由青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，藥材加水煎煮2次，分別濃縮至含0.5、1.0、1.5 g/ml原藥材的藥液，作為川芎龍蛭湯低、中、高劑量組。芪蛭通絡(luò)膠囊(0.5 g/粒，山西振東制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20181213)，尼龍線栓購自北京沙東生物技術(shù)有限公司，水合氯醛購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒和2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色購自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司(批號(hào)分別為：AS1055A、AS1055B和AS1095)，TNF-α、Ang-1和VEGF試劑盒購自碧云天生物科技有限公司(批號(hào)分別為：J190064、J190007和J180079)，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(碧云天生物科技有限公司，批號(hào)分別為：201903171、201903115)，Trizol提取試劑盒購自TaKaRa公司(批號(hào)：AKA5101)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購自BIO-RAD公司(批號(hào)：L001751A)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司(批號(hào)：AK4102)，TNF-α、Ang-1、VEGF和GAPDH引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自Millipore公司(批號(hào)：K5EA5859N)，山羊抗兔IgG購自Abcam公司(批號(hào)：150077)，TNF-α、Ang-1、VEGF單抗購自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司(批號(hào)分別為bs-4617R、bs-0920R和bs-0167R)。實(shí)驗(yàn)儀器：手術(shù)器械(蘇州六六視覺醫(yī)療設(shè)備公司)，BX60顯微鏡(日本Olympus Optical公司)，ELx800酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)，電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀〔伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司〕,SIM凝膠成像儀(美國西盟生命技術(shù)有限公司),反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR擴(kuò)增分析系統(tǒng)(美國羅氏公司)。

1.3模型建立及分組 將60雄性SD大鼠用5%水合氯醛麻醉，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和川芎龍蛭湯低、中、高劑量組和陽性組各10只。除對(duì)照組外，其他5組采用改良閉塞線栓法栓塞大腦中動(dòng)脈建立實(shí)驗(yàn)性腦缺血損傷大鼠模型〔9〕，去除大鼠右側(cè)背部被毛，仰臥四肢固定于手術(shù)臺(tái)板，頸部正中區(qū)域做豎切口，鈍性分離雙側(cè)筋膜及腺體，充分暴露右側(cè)頸動(dòng)脈，顯微鑷分離頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，靠近分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，距右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉近端絲線結(jié)扎，在右側(cè)頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端置絲線打一活結(jié)備用，逐層縫合筋膜和皮膚，切口用碘伏常規(guī)消毒。對(duì)照組除不插入線栓外，其余手術(shù)過程相同。

1.4給藥方法 于造模24 h后進(jìn)行干預(yù)。對(duì)照組和模型組給予生理鹽水灌胃，川芎龍蛭湯低、中、高劑量組給予不同濃度的川芎龍蛭湯灌胃，劑量均為10 ml/kg，1次/d，給藥7 d。陽性組給予芪蛭通絡(luò)膠囊，取芪蛭通絡(luò)膠囊內(nèi)容物制成0.1 g/ml的藥液，灌胃劑量為1.0 g/kg，1次/d，給藥7 d。

1.5神經(jīng)功能損傷程度 末次給藥24 h后評(píng)價(jià)神經(jīng)功能損傷程度，采用5級(jí)評(píng)分法〔10〕，無神經(jīng)功能缺損癥為0分；提尾懸空時(shí)對(duì)側(cè)前爪不能伸展為1分；行走時(shí)出現(xiàn)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；行走時(shí)出現(xiàn)困難且向左側(cè)傾倒為3分；無自主活動(dòng)且伴意識(shí)喪失為4分。

1.6腦梗死面積 采用TTC染色測(cè)定大腦梗死面積，腦片平鋪于2%TTC染色液中，避光孵育0.5 h，腦片用10%甲醛固定，梗死組織呈白色，正常腦組織呈紅色，通過Image-Pro Plus6.0 測(cè)量腦梗死面積。梗死體積=梗死體積/對(duì)側(cè)大腦半球體積。

1.7炎癥因子測(cè)定 處死各組大鼠前，眼球取血，離心，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定各組血清TNF-α、Ang-1和VEGF水平，按照說明書操作。

1.8腦組織HE染色 分別于末次給藥24 h后，眼球取血處死動(dòng)物，取腦組織，生理鹽水清洗，固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，乙醇水化，蘇木素染色，1%鹽酸乙醇溶液分化，自來水沖洗返藍(lán)，浸入伊紅染液，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠進(jìn)行封片，顯微鏡下觀察。

1.9RT-PCR檢測(cè)mRNA水平 取腦組織標(biāo)本50 mg，Trizol法提取總RNA，取1 μl提取的RNA，采用微量分光光度計(jì)于A260和A280檢測(cè)提取的RNA純度，去除DNA后以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行cDNA 合成，采用RT-PCR和相關(guān)軟件檢測(cè)TNF-α、Ang-1和VEGF的mRNA，40個(gè)循環(huán)，預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃ 10 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，延伸72℃ 5 min，測(cè)定mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.10Western印跡檢測(cè)蛋白 取100 mg皮膚組織標(biāo)本，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖3次，加入含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA低溫研磨，離心取上清，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，562 nm測(cè)定OD值，計(jì)算蛋白濃度，將膠板安裝于電泳槽中，倒入電泳液，按40 μg蛋白上樣，電泳條件為電壓80 V、30 min，樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)節(jié)電壓至120 V，電泳結(jié)束后，取出玻璃板，切去濃縮膠及分離膠，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，PVDF膜使用前浸于適量甲醇中活化，設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件(80 V、120 min)，冰浴，取出PVDF膜，37℃恒溫?fù)u床封閉2 h，將PVDF膜裁成長(zhǎng)條，置于TNF-α、Ang-1、VEGF一抗(1∶100)和GAPDH(1∶500)，4℃恒溫?fù)u床孵育過夜，1×TBST 洗PVDF膜3次，夾取PVDF膜置入二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，1∶5 000)1 h，1×TBST 洗PVDF膜3次，DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)條帶灰度，計(jì)算TNF-α、Ang-1和VEGF蛋白表達(dá)量。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)、LSD法。

2 結(jié) 果

2.1各自神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦梗死體積比較 與對(duì)照組比較，其余5組神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦梗死體積顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，川芎龍蛭湯低、中、高劑量組及陽性組神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦梗死體積顯著降低(P<0.05)；與川芎龍蛭湯低劑量組比較，川芎龍蛭湯中、高劑量組和陽性組神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦梗死體積顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2各組血清TNF-α、Ang-1和VEGF水平比較 與對(duì)照組比較，其余5組血清TNF-α、Ang-1和VEGF水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，川芎龍蛭湯低、中、高劑量組和陽性組血清TNF-α顯著降低，而Ang-1和VEGF水平顯著升高(P<0.05)；與川芎龍蛭湯低劑量組比較，川芎龍蛭湯中、高劑量組TNF-α水平顯著降低，Ang-1、VEGF水平顯著升高(P<0.05)，而陽性組各指標(biāo)無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦梗死體積及血清TNF-α、Ang-1、VEGF水平比較

2.3各組腦組織HE染色 對(duì)照組腦組織正常，腦細(xì)胞排列有序，細(xì)胞輪廓清晰、結(jié)構(gòu)完整，無水腫，形態(tài)正常，未見異常；與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞明顯減少，大量細(xì)胞壞死且排列紊亂，梗死灶內(nèi)細(xì)胞和血管壞死、腦組織細(xì)胞疏松、細(xì)胞形態(tài)改變、間質(zhì)水腫，川芎龍蛭湯低、中、高劑量組和陽性組腦組織損傷減輕，細(xì)胞稍顯疏松，水腫減輕。見圖1。

圖1 各組腦組織HE染色(×200)

2.4各組TNF-α、Ang-1和VEGF mRNA及蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，其余5組腦組織中TNF-α、Ang-1、VEGF mRNA及蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，川芎龍蛭湯低、中、高劑量組和陽性組血清TNF-α mRNA及蛋白水平顯著降低，而Ang-1、VEGF mRNA及蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與川芎龍蛭湯低劑量組比較，川芎龍蛭湯中、高劑量組TNF-α mRNA及蛋白水平顯著降低，Ang-1、VEGF mRNA及蛋白水平顯著升高(P<0.05)，而陽性組各指標(biāo)mRNA及蛋白水平無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組TNF-α、Ang-1和VEGF mRNA及蛋白水平比較

3 討 論

腦缺血損傷機(jī)制十分復(fù)雜，炎癥反應(yīng)在腦缺血損傷中具有重要作用，缺血腦組織中炎癥因子的大量表達(dá)促進(jìn)了炎癥反應(yīng)，其中TNF-α是大腦缺血損傷中最重要炎癥細(xì)胞因子。TNF-α在腦組織中主要由星形細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌。金平等〔11〕發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α等免疫炎性因子與β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42表達(dá)水平明顯升高，免疫炎性反應(yīng)或與慢性腦缺血所導(dǎo)致的腦組織Aβ1～42異常沉積有關(guān)。本研究給予不同劑量川芎龍蛭湯后可顯著降低血清TNF-α及腦組織中TNF-α mRNA和蛋白水平。這可能與川芎龍蛭湯方中枸杞多糖抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB和炎癥反應(yīng)有關(guān)，對(duì)缺血再灌注小鼠腦損傷有明顯保護(hù)作用，石菖蒲、丹參、全蝎等通竅活血藥降低大鼠腦缺血再灌注損傷時(shí)炎癥細(xì)胞因子的水平，從而減輕腦缺血再灌注損傷程度〔12〕。

腦缺血損傷直接引發(fā)局部腦組織缺血和缺氧，新生血管能明顯增加缺血周邊的腦血流量，微血管新生是重建缺血缺氧區(qū)域血供的主要途徑，血管新生程度直接關(guān)系到缺血組織預(yù)后。血管生成素是由血管內(nèi)皮周圍組織分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，有很強(qiáng)的促血管生成作用，Ang-1在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與周圍基質(zhì)和間質(zhì)之間起著至關(guān)重要的作用，Ang-1低表達(dá)使新生血管不穩(wěn)定且易發(fā)生滲漏，高表達(dá)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和鄰近的周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增多，毛細(xì)血管緊密，保護(hù)新生血管〔13〕。張涓等〔14〕發(fā)現(xiàn)，Ang-1/內(nèi)皮細(xì)胞TEK酪氨酸激酶(Tie)2信號(hào)通路參與血管生成的最后階段，促進(jìn)損傷神經(jīng)功能恢復(fù)，在血管新生、神經(jīng)再生中發(fā)揮重要作用。本研究給予不同劑量川芎龍蛭湯后可顯著升高血清Ang-1和腦組織中Ang-1 mRNA及蛋白水平，這與川芎龍蛭湯方中川芎、地龍、水蛭等活血化瘀類中藥通過血管生成素和整合素通路干預(yù)促進(jìn)血管生成、提高腦血流量、增強(qiáng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、上調(diào)某些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)、使腦缺血部位的血管新生等有關(guān)〔15〕。

VEGF是血管生成的關(guān)鍵性因子，在腦缺血缺氧的誘導(dǎo)下迅速增多，啟動(dòng)血管生成，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，參與腦缺血損傷病理過程中參與神經(jīng)和血管的重塑〔16〕。VEGF可促進(jìn)血管新生，保護(hù)神經(jīng)元免受缺血缺氧導(dǎo)致的損傷，參與并調(diào)控腦缺血后血管新生，腦缺血可誘導(dǎo)VEGF表達(dá)上調(diào)。腦缺血發(fā)作患者血清缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α、VEGF水平升高，腺苷預(yù)處理應(yīng)用于局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠，增加VEGF、HIF-1α表達(dá)以保護(hù)腦組織，從而保護(hù)缺血神經(jīng)元〔17〕。本研究給予不同劑量川芎龍蛭湯后可顯著升高血清VEGF及腦組織中VEGF mRNA和蛋白水平，這與川芎龍蛭湯方中川芎、生黃芪等激活HIF-1α/VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，升高缺血再灌注大鼠血清膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、VEGF水平及缺血腦組織Notch1 mRNA表達(dá)、促進(jìn)腦缺血損傷大鼠腦內(nèi)血管新生等有關(guān)〔18〕。

綜上，實(shí)驗(yàn)性腦缺血損傷模型大鼠TNF-α、Ang-1和VEGF水平顯著升高，給予川芎龍蛭湯可顯著改善腦組織損傷，其機(jī)制與降低TNF-α、升高Ang-1和VEGF水平有關(guān)。