低電離輻射對肝癌模型兔免疫功能的影響

張雨虹 鄭一凡 任虹彥 楊強 李淼 榮瑋 郝利國

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，齊齊哈爾 黑龍江 161000；2病理學(xué)院微形態(tài)中心)

國際癌癥機構(gòu)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2018年，全球新發(fā)癌癥病患1 810萬例，死亡人數(shù)960萬，其中肝癌發(fā)病率和死亡率最高且呈逐年上升趨勢，早已成為最致命的惡性腫瘤之一〔1～3〕。免疫治療和靶向治療已成為近年來肝癌治療的重要手段，但其治療的機制尚不清楚〔4〕。其中，低電離輻射對免疫功能具有重要意義〔5〕。研究表明低電離輻射對正常機體的免疫功能有增強作用，然而低電離輻射對患瘤機體的免疫功能影響報道較少〔6〕。本研究探討低電離輔射對肝癌模型兔免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 正常家兔15只，4～5個月齡、體重2～3 kg，雌雄均可，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，在動物實驗中心飼養(yǎng)，條件為溫度15～25℃，相對濕度40%～70%，飲用水及飼料均經(jīng)滅菌處理。

1.2藥品與儀器 脫毛劑(硫化鈉)、75%乙醇、20%烏拉坦、安爾碘溶液、0.9%等滲生理鹽水、青霉素、VX-2組織塊(由哈爾濱醫(yī)大學(xué)附屬第四醫(yī)院提供)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(江萊生物：上海將來實業(yè)股份有限公司)、酶標儀、離心機、恒溫箱、數(shù)字化彩色超聲診斷儀(飛一諾科技有限公司)、瓦里安直線加速器IX、切片機、顯微鏡。

1.3分組 將15只家兔采用隨機數(shù)字表法分為空白組(正常家兔)、對照組(未經(jīng)低電離輻射的肝癌模型兔)和實驗組(經(jīng)低電離輻射的肝癌模型兔)各5只?？瞻捉M不種瘤，不照射；對照組種瘤，不照射；實驗組種瘤、照射。

1.4建模 (1)VX-2瘤塊稀釋液制備。把已成功在后腿種植荷瘤兔處死在無菌環(huán)境中，取出腫瘤組織，去除壞死組織，用眼科剪剪成組織碎塊10份，加入等量的等滲鹽水混勻，制成瘤塊組織懸液，備用。(2)組織懸液種植。實驗組和對照組家兔于術(shù)前禁食 24 h，禁水8 h，耳緣靜脈注射麻醉(20%烏拉坦，5 ml/kg)，將麻醉的家兔仰臥位固定于實驗臺上，上腹部備皮，安爾碘消毒，使用B超機高頻探頭找到家兔肝臟位置，將準備好的組織液在超聲引導(dǎo)下注射。術(shù)后，對實驗組和對照組兔注射抗生素，并每天監(jiān)測家兔狀況。(3)照射。實驗組于種植腫瘤15 d后，使用齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院放療科瓦里安直線加速器Ⅸ對實驗組家兔進行單次全身照射，照射劑量為75 mGy〔7,8〕。

1.5檢測項目 (1)家兔血常規(guī)指標及血清中IgG、IgM水平檢測:分別于照射前3 h和照射后第4、8天，取家兔外周血2～3 ml，交送齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗科進行檢測。(2)家兔血清中白細胞介素(IL)-4含量檢測：分別于照射前3 h和照射后第4、8天，取家兔外周血2～3 ml，2 500 r/min離心20 min，取上層血清，用ELISA檢測IL-4水平。(3)巨噬細胞吞噬功能檢測：于照射后第14天向家兔腹腔注射淀粉溶液，于照射后第15天向家兔腹腔注入2%雞紅細胞懸液，1 h后取出腹腔液進行涂片，采用瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液染色，于油鏡下觀察巨噬細胞吞噬的雞紅細胞情況。每組載玻片于鏡下選取10個視野分別計數(shù)200個巨噬細胞及吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)，取平均值計算其吞噬百分率〔9〕。(4)家兔脾臟指數(shù)測定：于照射后第15天，處死所有家兔，取出3組家兔脾臟，稱重并計算其脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(g)/家兔體重(kg)。(5)腫瘤組織病理學(xué)觀察：于照射后第15天，處死家兔，取出腫瘤組織后，立即放入10%的甲醛溶液固定，進行腫瘤組織石蠟切片制備，經(jīng)水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色后，于鏡下觀察實驗組與對照組家兔腫瘤組織的形態(tài)學(xué)差異。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進行配對t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 對照組和實驗組接種腫瘤塊3 d后，精神狀態(tài)良好，可以自行進食和行走。 接種15 d后，對照組和實驗組體重均減輕且精神狀態(tài)不佳，對實驗組進行低電離輻射。接種20 d后，對照組精神狀況差，其中一只家兔拒絕進食，體重嚴重減輕，與接種后第24天死亡；實驗組精神狀態(tài)良好，體重開始回升，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。于接種第30天處死所有家兔后解剖，發(fā)現(xiàn)對照組腹腔有惡臭味，大部分肝臟被腫瘤侵襲，腹腔臟器出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，部分組織壞死化膿；實驗組腹腔肝臟被腫瘤侵襲，但未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移?？瞻捉M在實驗過程中狀態(tài)未發(fā)生變化。

2.2B超監(jiān)測 使用B超機高頻探頭(7～10 MHz)，每3 d對對照組和實驗組家兔的肝臟移植腫瘤進行1次檢測。接種腫瘤7 d后，觀察到對照組和實驗組家兔肝臟處有高回聲團塊，邊界尚清，彩色多普勒血流顯像示腫瘤內(nèi)部呈短棒狀血流信號，見圖1。對照組和實驗組腫瘤塊長徑變化在接種后第7天〔(9.96±0.50) vs (10.26±0.22)mm〕、第15天〔(17.84±0.48) vs (17.96±0.27)mm〕、第25天〔(32.30±0.64) vs (30.60±0.60)mm〕均無顯著差異(均P>0.05)。

圖1 對照組與實驗組超聲下腫瘤影像及實驗組彩色多普勒腫瘤血流顯像

2.3實驗組家兔低電離輻射前后血常規(guī)指標變化 實驗組照射后第4天各項指標較照射前明顯下降，照射后第8天各項指標較第4天明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 實驗組照射前后血常規(guī)指標變化

2.4各組家兔低電離輻射前后IL-4分泌水平 實驗組照射后第4天IL-4水平較照射前明顯上升(P<0.05)；照射后第8天的IL-4水平較照射后第4天有所下降，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。照射后，對照組IL-4水平較空白組明顯下降，實驗組IL-4水平較對照組明顯上升(P<0.05)，見表2。

表2 各組照射前后IL-4分泌水平比較

2.5各組家兔低電離輻射前后IgG、IgM分泌水平 實驗組照射后第4天的IgG、IgM水平較照射前明顯上升(P<0.05)；照射后第8天的IgG、IgM較照射后第4天有所下降，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，照射后，對照組IgG、IgM水平較空白組下降，實驗組的IgG、IgM較對照組升高，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組照射前后IgG、IgM水平比較

2.6低電離輻射對3組家兔巨噬細胞吞噬功能、脾臟指數(shù)的影響 鏡下觀察到細胞核呈紫紅色，胞質(zhì)呈淺紅色，可見被吞噬的雞紅細胞，見圖2。對照組巨噬細胞吞噬百分率〔(67.69±2.00)%〕較空白組〔(79.55±1.38)%〕明顯下降，實驗組巨噬細胞吞噬百分率〔(75.26±1.55)%〕較對照組明顯升高(均P<0.05)。對照組脾臟指數(shù)〔(0.44±0.02)g/kg〕較空白組〔(0.84±0.03)g/kg〕明顯下降，實驗組脾臟指數(shù)〔(0.76±0.02)g/kg〕較對照組明顯升高(均P<0.05)。

圖2 實驗組巨噬細胞吞噬雞紅細胞(蘇木素-伊紅染色，油鏡，×1 000)

2.7病理學(xué)檢查結(jié)果 實驗組可見灰白色腫瘤、伴灶性出血壞死、周邊包膜完整。種植瘤呈類圓形或橢圓形、血供豐富、質(zhì)地較硬，切開后可見液化性壞死。病理組織學(xué)切片檢查，鏡下可見大量纖維組織增生，炎細胞浸潤，假小葉之間血管擴張充血。瘤細胞排列紊亂，呈條索或團塊狀，其間可見血竇，瘤細胞大小不等，形狀不規(guī)則，胞質(zhì)富含嗜酸性，細胞核大深染，異質(zhì)性高，多見瘤巨細胞及病理性核分裂，見圖3。高倍鏡下轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)見大量癌細胞巢，癌細胞體積大，核大深染，淋巴結(jié)的正常結(jié)構(gòu)被完全破壞。對照組與實驗組家兔腫瘤組織的大體標本與鏡下切片觀察并無顯著差異(P>0.05)。

(×100)

(×400)

3 討 論

研究表明，低電離輻射抑瘤效應(yīng)不是通過對腫瘤直接殺傷，而是通過自身調(diào)節(jié)、提高機體免疫力的方式實現(xiàn)的〔10，11〕。低電離輻射的興奮效應(yīng)和適應(yīng)性反應(yīng)已經(jīng)被廣泛證實。低電離輻射可使一些細胞因子分泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強，免疫細胞的相互作用提高，進而提升機體的免疫功能〔12〕。本研究主要通過檢測低電離輻射后肝癌模型兔的免疫學(xué)指標來研究其免疫功能變化。因腫瘤形態(tài)發(fā)生變化需要一定的時間，且病灶大小會因炎癥、水腫、壞死等因素有所改變，不能準確反映腫瘤大小。故超聲檢測并未顯示顯著性差異。各組腫瘤病理學(xué)觀察并無顯著性差異，可能是因其移植瘤來源相同，且對于中晚期大負荷腫瘤，單用免疫治療難以奏效，應(yīng)將其視為輔助療法配合手術(shù)。

低電離輻射誘導(dǎo)不同細胞因子的釋放可增強或抑制機體的免疫功能，同時也可促使初始T細胞向輔助型T細胞轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)門h2免疫反應(yīng)〔13，14〕。本研究結(jié)果顯示，輻射后實驗組較對照組IL-4水平有所升高，其機制可能在于低電離輻射活化免疫細胞促進其細胞因子的分泌與調(diào)節(jié)。IL-4主要由Th2細胞產(chǎn)生，且具有廣泛的生物學(xué)活性，可以增強特異性和非特異性細胞的殺傷功能。其在機體免疫應(yīng)答中發(fā)揮的作用是復(fù)雜的，IL-4可調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞的平衡，參與體液免疫；也能通過上調(diào)干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達參與細胞免疫〔15〕。且研究發(fā)現(xiàn)IL-4可通過阻滯細胞周期來阻礙癌細胞的生長〔16〕。故低電離輻射或可通過上調(diào)IL-4分泌水平，來達到抑瘤效應(yīng)。B細胞通過產(chǎn)生免疫球蛋白來發(fā)揮其在體液免疫中的作用，IgG、IgM 均為機體免疫功能評價的常用指標〔17〕。關(guān)于低電離輻射對體液免疫的研究較少，目前認為，低電離輻射可作為一種特殊的弱抗原，反復(fù)刺激B細胞的多克隆活化和誘導(dǎo)免疫球蛋白的形成，使機體體液免疫功能增強〔12〕。機體接受低電離輻射刺激后，可產(chǎn)生大量具有高親和力的IgG、IgM抗體〔18〕。本研究結(jié)果說明低電離輻射可提升患瘤機體免疫球蛋白水平。

低劑量電離輻射對機體的作用是復(fù)雜多變的，既有免疫興奮效應(yīng)同時也伴隨著有害效應(yīng)〔19〕。實驗組家兔照射后第八天的免疫球蛋白、IL-4分泌水平相較于第四天，并無明顯差異，可能是因為電離輻射在抑制免疫抑制的同時損傷了機體的T細胞，具體原因尚不清楚。對照組呈下降趨勢，可能是腫瘤導(dǎo)致T細胞亞群發(fā)生改變而使免疫功能處于抑制狀態(tài)〔20〕。

機體受到輻射后，可引起細胞水平甚至是器官水平的變化，而造血系統(tǒng)是最敏感的靶器官之一。有文獻報道，機體血液系統(tǒng)在短時期受到低電離輻射后會逐漸恢復(fù)，其機制可能在于低電離輻射對機體的生物學(xué)效應(yīng)，持續(xù)時間較短〔21，22〕。如何在運用低電離輻射免疫興奮效益的基礎(chǔ)上最大程度地避免有害效應(yīng)，仍是一個值得長期探討的問題。

巨噬細胞在非特異性免疫中起重要作用，參與機體抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等過程〔23〕。低電離輻射可直接增強巨噬細胞的反應(yīng)性，也可促進淋巴細胞的細胞因子分泌，從而增強巨噬細胞吞噬功能〔24〕。本實驗結(jié)果可證實低電離輻射對巨噬細胞吞噬功能的促進作用。脾臟是外周免疫器官，為各種成熟淋巴細胞聚集和發(fā)生免疫反應(yīng)的場所，一定程度上可反映機體的免疫功能〔25～28〕。低電離輻射可促進胸腺細胞和脾細胞多種蛋白的表達量升高，還可促進其分泌多種細胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)〔18〕；其對提高機體免疫功能可表現(xiàn)為細胞增殖動力學(xué)改變，如作用于胸腺、脾臟后，其增殖特性發(fā)生適應(yīng)性變化，細胞周期縮短，增殖加快〔29〕。本實驗結(jié)果提示低電離輻射促進脾臟淋巴細胞與脾細胞的增殖分化。

綜上，低電離輻射對免疫系統(tǒng)的影響主要表現(xiàn)為免疫活性細胞數(shù)量及其細胞因子的分泌水平、免疫球蛋白的分泌水平、抗體形成能力和細胞因子調(diào)節(jié)等一系列細胞及分子水平變化，最終導(dǎo)致機體免疫功能改變，并且對機體免疫功能有正向調(diào)節(jié)作用。