馬齒莧炒炭前后涼血止血作用比較

李昕曈 王炳然 蔣常鵬 陳晶 高紅梅 (長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117)

馬齒莧是一種野生中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》具有清熱涼血、抗炎、解毒、止痢等功效〔1～3〕?，F(xiàn)代藥理作用研究顯示，馬齒莧含有抗腫瘤物質(zhì)，具有保護(hù)神經(jīng)、調(diào)節(jié)骨骼肌、平滑肌等作用〔3，4〕。但目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)馬齒莧治療血熱出血藥效的研究較少，故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠血熱出血模型來(lái)探討馬齒莧炒炭前后的涼血止血變化。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)藥物 馬齒莧藥材購(gòu)自河北凱達(dá)藥業(yè)有限公司，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)專(zhuān)家鑒定為合格產(chǎn)品。云南白藥(國(guó)藥準(zhǔn)字Z53020798)；干酵母(國(guó)藥準(zhǔn)字H44022243)。馬齒莧炒炭的制備：取凈馬齒莧150 g，投入已預(yù)熱30 min的炒藥機(jī)中，于200℃炒制15 min，即得馬齒莧炭〔5〕。

藥液制備：取馬齒莧及馬齒莧炭適量2份，各自加10倍量的蒸餾水和70%乙醇，置于回流裝置中提取2 h，回流后將中藥渣加適量蒸餾水進(jìn)行第2次回流，時(shí)間為1 h，把兩次濾液混合搖勻，再減壓濃縮至1 g/ml，即得馬齒莧的水提取物(SS)和馬齒莧的醇提取物(SC)。按上述方法制備得到馬齒莧炭的水提取物(TS)和馬齒莧炭的醇提取物(TC)。稱(chēng)量2.5 g云南白藥粉用100 ml蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，即所?.025 g/ml的云南白藥液。再稱(chēng)量20 g干酵母粉取100 ml蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，即所需干酵母液，干酵母液注意現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2動(dòng)物 SD大鼠，SPF等級(jí)，選取符合實(shí)驗(yàn)要求的體長(zhǎng)18～20 cm健康大鼠42只，體重200～240 g，SD大鼠證號(hào)為SCXK(遼)2020-0001，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021057)。飼養(yǎng)條件為濕度57%～62%，室溫22～25℃。

1.3試劑 大鼠血漿中內(nèi)源性凝血因子活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)品批次編號(hào)R0053)、血漿纖維蛋白原(Fib)試劑盒(產(chǎn)品批次編號(hào)R0079)、凝血酶時(shí)間(TT)試劑盒(產(chǎn)品批次編號(hào)49844)、凝血酶原時(shí)間(PT)試劑盒(產(chǎn)品批次編號(hào)R0059)、氯化鈣溶液(CaCl2，產(chǎn)品批次編號(hào)R0053)、緩沖液(TC Buffer，產(chǎn)品批次編號(hào)R0043)，上述溶液均購(gòu)自希森美康生物科技(無(wú)錫)有限公司；負(fù)壓血樣采集器2 ml〔抗凝劑：乙二胺四乙酸二鉀(枸櫞酸鈉)，產(chǎn)品批次編號(hào)20191104〕、負(fù)壓血樣采集器2 ml(抗凝劑：EDTA-K2，產(chǎn)品批次編號(hào)20191101)，血樣采集容器肝素鈉1 ml(抗凝劑：肝素鈉，產(chǎn)品批次編號(hào)200702)，購(gòu)自廣州健福醫(yī)療科技有限公司。

1.4儀器 數(shù)顯自動(dòng)恒溫水浴鍋(HH-2型，購(gòu)自國(guó)華電器有限公司)；全自動(dòng)自清洗血流變儀(LBY-N6B型)；全自動(dòng)血凝分析儀(CA-600型)；全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(ProcyteDx*型，購(gòu)自愛(ài)德士公司)；低速離心機(jī)(TDL-80-2B型)；電子天平(JM-A5002型)。

1.5方法

1.5.1分組、造模及給藥 42只健康大鼠按照雌雄各半原則，每組6只，共分為7組：血熱出血組、陽(yáng)性藥物組(給予云南白藥液)、SS組、SC組、TS組、TC組、對(duì)照組。各組大鼠給藥采取灌胃方法，除血熱出血組和對(duì)照組，各組給予藥液為10 ml/kg，血熱出血組與對(duì)照組大鼠進(jìn)行灌胃給予10 ml/kg蒸餾水，每24 h給藥一次，連續(xù)灌胃7 d。第7天開(kāi)始造模，選取對(duì)照組的大鼠在其背部皮下注射10 ml/kg蒸餾水，其余各組背部皮下注射干酵母液10 ml/kg，注射5 h后，各組大鼠給予1 ml無(wú)水乙醇進(jìn)行灌胃(對(duì)照組除外)，對(duì)照組給予1 ml蒸餾水進(jìn)行灌胃。上述操作完成后觀察大鼠1 h，1 h后對(duì)照組和血熱模型組選擇用蒸餾水進(jìn)行灌胃，其他5組給藥組灌胃相應(yīng)受試藥物，選擇在造模前和造模后2、4、6、8 h測(cè)定各組大鼠肛溫，記錄肛溫變化情況。第8天時(shí)，對(duì)大鼠最后一次灌胃給予相應(yīng)受試藥物治療，操作方法同上，給藥之后等待1 h，采用10%水合氯醛溶液對(duì)所有的大鼠進(jìn)行注射麻醉，麻醉后靜脈取血置于37℃恒溫箱內(nèi)。

1.5.2血液黏度指標(biāo)的測(cè)定 取全血1 ml，肝素鈉溶液全血抗凝，測(cè)定大鼠的全血中切黏度、全血低切黏度、全血高切黏度參數(shù)，進(jìn)行記錄。

1.5.3凝血功能指標(biāo)的測(cè)定 取全血2 ml，于3.8%枸櫞酸鈉溶液中全血抗凝，3 000 r/min離心10 min進(jìn)行分離，取上清血漿部分，測(cè)定Fib、PT、APTT、TT參數(shù)，進(jìn)行記錄。

1.5.4血液相關(guān)參數(shù)的測(cè)定 取全血2 ml，于EDTA-K2溶液中全血抗凝，測(cè)定血紅蛋白計(jì)數(shù)(HGB)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、血細(xì)胞比容(HCT)、平均血小板體積(MPV)、紅細(xì)胞(RBC)參數(shù)，進(jìn)行記錄。

1.5.5組織病理學(xué)檢查 麻醉采血后，處死大鼠。解剖大鼠取腎、胃、肝、肺組織，用生理鹽水清洗，肉眼目測(cè)大鼠臟器出血變化的狀態(tài)。大鼠的肺部、胃部用中性甲醛溶液(濃度為10%)進(jìn)行固定，切片，顯微鏡測(cè)定大鼠的肺部、胃部組織的病理切片參數(shù)，進(jìn)行記錄。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)及完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠造模前和造模后肛溫的情況 與對(duì)照組比較，血熱出血組造模后2、4、6、8 h肛溫顯著升高(P<0.01)。除造模后6 h TS組及造模后8 h TS組和TC組與血熱出血組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，SS組、SC組、TS組、TC組造模后各時(shí)間點(diǎn)肛溫均顯著低于血熱出血組(P<0.05,P<0.01)。造模后2、4、6、8 h SS組肛溫顯著低于TS組(P<0.01)，SC組肛溫顯著低于TC組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 造模前和造模后各組肛溫比較

2.2各組造模前和造模后血液黏度比較 與對(duì)照組比較，血熱出血組全血低、中、高切黏度均顯著升高(P<0.01)；與血熱出血組比較，SS組、SC組顯著降低全血低、中、高黏度(P<0.01)；TS組和TC組顯著降低全血低切黏度(P<0.01),TS組顯著降低全血中切黏度，TC組顯著降低全血高切黏度(P<0.05)。SS組與TS組、SC組與TC組比較全血低、中、高切黏度均顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.3各組造模前和造模后凝血功能比較 與對(duì)照組相比，血熱出血組Fib明顯升高(P<0.01)，APTT、PT、TT時(shí)間增加顯著(P<0.01)；與血熱出血組比較，陽(yáng)性藥物組、SS組、SC組、TS組、TC組APTT、TT、PT顯著縮短(P<0.05,P<0.01),SS組、SC組、TS組、TC組Fib顯著降低(P<0.05，P<0.01)。TS組與SS組、TC組與SC組比較APTT、Fib、PT顯著更低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組造模前和造模后全血黏度及凝血功能比較

2.4各組血液參數(shù)比較 與對(duì)照組相比，血熱出血組RBC、HCT、HGB、MPV明顯較高(P<0.01)。與血熱出血組比較SS組、SC組明顯降低HCT、HGB、RBC、MPV(P<0.05，P<0.01)；TC組明顯降低模型大鼠的RBC、HCT含量(P<0.05)；各給藥組與模型組分析數(shù)據(jù)比較，顯示降低大鼠MPV含量，差異明顯(P<0.05)；SS組與TS組、SC組與TC組比較RBC、HCT、HGB均顯著降低(P<0.01)；PLT含量在各組間無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表3。

表3 各組血液參數(shù)比較

2.5大鼠造模前和造模后各組器官組織變化情況

2.5.1肉眼直接觀察大鼠臟器變化 與對(duì)照組比較，血熱出血組大鼠的肺、胃、肝部具有明顯出血點(diǎn)，腎的顏色較深，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)造模方法正確，數(shù)據(jù)可靠。各給藥組與血熱出血組進(jìn)行對(duì)比分析，增強(qiáng)止血效果明顯，出血點(diǎn)減少，顏色較淡。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠臟器形態(tài)

2.5.2肺部病理學(xué)組織切片 對(duì)照組大鼠的肺泡完整，無(wú)炎性物質(zhì)滲出，無(wú)出血；血熱出血組大鼠肺泡間隙有大量紅細(xì)胞滲出，存在炎性浸潤(rùn)，部分肺泡結(jié)構(gòu)明顯被破壞；SS組和SC組改善肺間質(zhì)炎性浸潤(rùn)，但仍有部分出血點(diǎn)；TS組和TC組可以有效改善肺泡腔內(nèi)的紅細(xì)胞浸潤(rùn)，減少出血點(diǎn)，效果優(yōu)于SS組和SC組。見(jiàn)圖2。

圖2 各組肺組織情況(HE染色，×40)

2.5.3胃部病理學(xué)組織切片 對(duì)照組胃組織正常，上皮細(xì)胞呈現(xiàn)出單層柱狀排列狀態(tài)；血熱出血組大鼠胃組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)；觀察SS組和SC組顯微圖片可看出馬齒莧能夠改善部分模型大鼠的胃潰瘍情況，但仍有少量出血點(diǎn)存在；TS組和TC組對(duì)大鼠胃組織細(xì)胞呈現(xiàn)出柱狀排列狀態(tài)，說(shuō)明可明顯改善炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及紅細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖3。

圖3 各組胃組織情況(HE染色，×40)

3 討 論

馬齒莧(拉丁名為：Portulaca oleracea L.)生長(zhǎng)期為1年生草本植物，葉片伏地扁平，呈淡綠色，葉片周?chē)鷰в袖忼X狀，故得名馬齒莧〔6～9〕。馬齒莧含有多種營(yíng)養(yǎng)成分鈣、鐵、蘋(píng)果酸、二羥乙胺、葡萄糖、磷以及豐富的維生素C、胡蘿卜素、維生素E、維生素B等對(duì)人體有益處的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)〔10～12〕。

PT表示的是動(dòng)物組織里面血漿中凝血因子活性程度，TT表示動(dòng)物組織里面的抗凝物質(zhì)的狀態(tài)，TT的延長(zhǎng)與纖溶蛋白溶解系統(tǒng)功能的亢進(jìn)等因素有關(guān)，APTT表示內(nèi)源凝血的基本情況，特別是內(nèi)源凝血最初過(guò)程中的凝血因子綜合活性情況〔13～15〕，F(xiàn)ib表示的是動(dòng)物組織里面有凝血功能的蛋白質(zhì)，F(xiàn)ib含量升高，說(shuō)明大鼠的血液中始終處于一種高凝狀態(tài)，可以造成血流速度減緩，從而增加血液黏滯性；這些指標(biāo)的升高表明大鼠的凝血功能存在障礙，與組織病理切片結(jié)果綜合考慮，馬齒莧炒炭品改善大鼠的出血情況優(yōu)于馬齒莧。

RBC為機(jī)體中含量最多的一類(lèi)細(xì)胞，HGB能夠在RBC內(nèi)進(jìn)行傳送氧氣，是蛋白質(zhì)中的一種特殊物質(zhì)，HCT是在一定量的容積中RBC占有的百分含量，這三種指標(biāo)的升高，顯示大鼠的血液流變性功能受到了限制。本試驗(yàn)采取灌胃與皮下注射結(jié)合的方法順利地構(gòu)建了血熱出血模型，馬齒莧顯著降低RBC、HCT、HGB、MPV含量，改善了血液流變性，證實(shí)馬齒莧存在“涼血”作用；馬齒莧炭具有特異抑制血熱出血模型大鼠的凝血功效及抑制大鼠肺和胃的出血作用，其效果強(qiáng)于生品的馬齒莧。本研究進(jìn)一步說(shuō)明馬齒莧涼血作用強(qiáng)，止血作用稍弱；馬齒莧炒炭后止血作用增強(qiáng)，雖保留一定的涼血作用，但效果不及馬齒莧生品好。

馬齒莧性味酸、寒，炒制后涼血作用減弱，說(shuō)明馬齒莧可以通過(guò)炒制緩和其本身的寒涼之性，達(dá)到了調(diào)整藥物治療效果的目的，為中藥炮制的“炒以緩其性”提供依據(jù)。

綜上所述，馬齒莧炒炭前后可以不同程度地改善大鼠出血情況，馬齒莧涼血作用優(yōu)于馬齒莧炭，馬齒莧炭止血作用優(yōu)于馬齒莧。