鼻咽癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞ERCC1基因表達(dá)與放化療療效及預(yù)后的相關(guān)性

王偉鋒 張卓 李云冬 顧安琪 于亞捷 蔡奕錚 鄧曉聰

(海南省腫瘤醫(yī)院 1放療科一區(qū)，海南 ?？?570300；2頭頸外一科)

鼻咽癌是臨床常見的惡性腫瘤，在以鼻咽癌為代表的頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)中，順鉑聯(lián)合放療是局部晚期頭頸癌的基礎(chǔ)治療方案之一，但該方案的毒性反應(yīng)較大，且部分患者出現(xiàn)耐藥或放療抗拒而療效難盡人意；臨床迫切需要特異性靶標(biāo)來預(yù)測(cè)放療抗拒或順鉑治療的耐藥性，從而優(yōu)化治療方案，降低毒性反應(yīng)，提高治療效果。由于鉑類藥物的作用靶點(diǎn)是DNA，故DNA 修復(fù)能力的不同將直接導(dǎo)致個(gè)體間腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物敏感性的差異〔1〕；DNA切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(ERCC)1基因定位于染色19q13.2-13.3，作為核苷酸切除修復(fù)途徑系統(tǒng)的關(guān)鍵基因，其與DNA修復(fù)系統(tǒng)密切相關(guān)〔2〕。ERCC1參與鉑類耐藥及放療抗拒的發(fā)生；腫瘤組織中ERCC1表達(dá)量增高，鉑類聯(lián)合放療的PFS更差〔3，4〕，ERCC1的表達(dá)量與腫瘤的放射抗拒關(guān)系密切。隨著循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于臨床，對(duì)于頭頸部腫瘤患者可以通過檢測(cè)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)獲取ERCC1基因表達(dá)情況，從而及時(shí)調(diào)整治療方案，以期獲得更好的療效，本研究利用成熟的CTC檢測(cè)技術(shù)，通過檢測(cè)鼻咽癌患者CTC細(xì)胞ERCC1基因表達(dá)情況，預(yù)測(cè)療效并在治療后隨訪評(píng)估其表達(dá)程度與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1患者一般資料 海南省腫瘤醫(yī)院2018年2～12月就診的鼻咽癌初治患者42例，男37例，女5例，年齡18～70歲；中位年齡為46歲；均經(jīng)過鼻咽鏡活檢確診，臨床分期中Ⅱ期5例、Ⅲ期25例、Ⅳ期12例?；颊呔M(jìn)行影像學(xué)檢查〔鼻咽部及頸部磁共振成像(MRI)+增強(qiáng)，鼻咽部及頸部CT+增強(qiáng)；胸部CT，上腹部彩超，全身骨掃描，腦部MRI或全身單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(SPECT)/CT〕；入院時(shí)采血行血常規(guī)、生化、腫瘤標(biāo)志物等血液學(xué)檢查。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均行鼻咽部活檢病理明確為鼻咽癌，患者影像學(xué)未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，臨床TNM分期：Ⅱ～Ⅳ期；(2)美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評(píng)分≤2分；(3)白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥4×109/L，血紅蛋白≥90 g/L，血小板≥100×109/L；(4)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶小于1.5倍的正常值上限，肌酐清除率≥60 ml/min。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有惡性腫瘤病史或本次診斷為雙原發(fā)腫瘤；(2)之前接受過放療、化療或手術(shù)等其他抗腫瘤治療；(3)孕婦或哺乳期婦女；(4)原發(fā)灶或淋巴結(jié)行手術(shù)治療(活檢除外)。

1.2CTC分離及ERCC1基因檢測(cè) 患者均在開始治療前采血行CTC檢測(cè)并檢測(cè)ERCC1基因的表達(dá)情況，并作為基線特征記錄；患者在完成誘導(dǎo)化療后即放療前進(jìn)行第2次采血行CTC檢測(cè)，在完成全部放療后進(jìn)行第3次采血行CTC檢測(cè)?；颊哐獦硬杉笏陀缮钲谝嫔粕锛夹g(shù)股份有限公司進(jìn)行檢測(cè)，CTC檢測(cè)利用CanPatrolTM二代CTC檢測(cè)技術(shù)，運(yùn)用納米技術(shù)分離CTC，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞CTC和成團(tuán)的細(xì)胞微團(tuán)(CTM)的分離、鑒定和分型。先用免疫磁珠負(fù)向去除5 ml外周血中白細(xì)胞，然后通過納米膜過濾檢出CTC。CTC細(xì)胞分離后采用納米技術(shù)全面分離所有類型CTCs，其中CTC富集效率≥80%。每個(gè)CTC細(xì)胞利用熒光原位雜交(FISH)分型，采用多重mRNA原位分析技術(shù)用來標(biāo)記ERCC1基因。

1.3化療 患者均按照2017年鼻咽癌國(guó)際臨床靶區(qū)勾畫指南〔5〕推薦治療方案，行誘導(dǎo)化療后并接受放化療同步治療。誘導(dǎo)化療期間，TP方案如下：多西紫杉醇(多西他賽，0.5 ml/20 mg；深圳萬樂藥業(yè)生產(chǎn))75 mg/m2，靜脈滴注，d1；順鉑(10 mg/支；山東羅欣藥業(yè)生產(chǎn)) 100 mg/m2，靜脈滴注，d1；21 d為1個(gè)周期；化療前均予以水化等預(yù)處理，誘導(dǎo)化療周期數(shù)視患者腫瘤退縮情況及患者耐受情況決定，總療程不超過3個(gè)周期，一般不少于2個(gè)周期。同步治療方案：順鉑100 mg/m2，21 d為1個(gè)周期?；颊咧委熐熬柰瓿梢?guī)定的影像學(xué)檢查明確臨床分期；患者完成誘導(dǎo)化療后進(jìn)行擇期根治性放療，患者放療時(shí)同步順鉑每3 w一次化療(80～100 mg/m2)，至放療結(jié)束，對(duì)于完成全部治療后仍有腫瘤殘留者，予以口服卡培他濱(0.5 g×12片，羅氏制藥)1.00～1.25 g/m2連續(xù)口服14 d，21 d為1個(gè)周期；服用3個(gè)周期。

1.4放射治療 患者均采用頭頸肩熱記憶膜固定，均使用調(diào)強(qiáng)放療，6 MV X射線并視情況加用電子線治療，進(jìn)行靶區(qū)勾畫。放療計(jì)劃的劑量為：原發(fā)灶的大體腫瘤靶區(qū)(GTV)劑量66.0～71.4 Gy/(30～33次)，頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)GTVnd劑量采用66.0 Gy/(30～32次)。高、低危臨床靶區(qū)(CTV)劑量分別為60.0 Gy/(30～32次)和54.0 Gy/(30～32次)。對(duì)于新輔助化療降期患者，以化療前病灶影像勾畫GTV、GTVnd和CTVnd包膜無受侵者按新輔助化療后實(shí)際退縮情況的影像勾畫。包膜受侵者按化療后的影像勾畫，同時(shí)包括化療前影像顯示的外侵區(qū)域。對(duì)于鼻腔內(nèi)腫瘤突出部分，按化療后實(shí)際退縮情況勾畫靶區(qū)。完成放療計(jì)劃處方劑量后，對(duì)于淋巴引流區(qū)仍殘留的腫大淋巴結(jié)，根據(jù)影像學(xué)所見淋巴結(jié)大小、深度選擇合適能量的電子線單野推量照射，盡量達(dá)到消除腫大淋巴結(jié)的劑量，最高劑量80 Gy。正常組織劑量限制及處方劑量要求參見放射治療器官限量國(guó)際指南〔6〕相關(guān)劑量限制標(biāo)準(zhǔn)。

1.5療效評(píng)價(jià)及隨訪 于2018年3月2日第1例患者完成全部治療后隨訪至2020年12月31日。所有患者治療后隨訪滿2年，最長(zhǎng)34個(gè)月，中位隨訪時(shí)間19個(gè)月。所有患者治療結(jié)束后第1～3年每3個(gè)月復(fù)查1次鼻咽及頸部CT/MRI、淋巴引流區(qū)彩超并體檢協(xié)助、胸部及上腹部CT，必要時(shí)行間接鼻咽鏡檢查，了解有無局部復(fù)發(fā)及常見部位遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；隨訪結(jié)果詳細(xì)記錄并統(tǒng)計(jì)患者2年總生存率(OS)，2年無進(jìn)展生存(DFS)和局部無復(fù)發(fā)生存(LRFS)，分析不同階段CTC中ERCC1基因不同表達(dá)強(qiáng)度〔ERCC1表達(dá)陽(yáng)性率≥75%為高表達(dá)(H-ERCC1)組；ERCC1表達(dá)陽(yáng)性率≥25%且<75%為中表達(dá)(M-ERCC1)組；ERCC1表達(dá)陽(yáng)性率<25%為低表達(dá)(L-ERCC1)組。在分析ERCC1基因表達(dá)強(qiáng)度對(duì)生存的影響時(shí)，為了便于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，治療的不同階段不表達(dá)患者全部按低表達(dá)計(jì)〕對(duì)患者預(yù)后的影響。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。臨床分類資料采用相對(duì)數(shù)描述，隨訪生存分析采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。OS、DFS和LRFS情況的組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CTC細(xì)胞及ERCC1基因表達(dá)情況 誘導(dǎo)化療前不同臨床分期患者ERCC1表達(dá)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。放療前及放化療后不同臨床分期、誘導(dǎo)化療周期數(shù)患者ERCC1表達(dá)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床特征患者CTC中ERCC1陽(yáng)性率比較〔n(%)〕

2.2療效分析

2.2.1近期療效 所有患者完成標(biāo)準(zhǔn)方案的放化療；28例(66.7%)出現(xiàn)Ⅲ度放射性口腔黏膜炎，14例(33.3%)出現(xiàn)Ⅱ度放射性口腔黏膜炎；26例(61.9%)患者出現(xiàn)Ⅲ度骨髓抑制；38例(90.6%)患者按期完成擬定的放療計(jì)劃，4例(9.5%)患者因放化療相關(guān)反應(yīng)較嚴(yán)重，延遲1 w完成放療計(jì)劃；完成放療后1個(gè)月評(píng)估CR者達(dá)90.6%(38/42)，4例(9.5%)患者完成放療后頸部腫塊仍殘留，完成放療后繼續(xù)服用卡培他濱維持治療3個(gè)月后，再次復(fù)查，頸部殘留腫塊完全消失；治療前合并顱神經(jīng)癥狀者共計(jì)9例(21.4%)，完成放療后全部癥狀緩解(100.0%)。

2.2.2遠(yuǎn)期療效 1年和2年生存率分別為97.1%、91.4%(圖1)；隨訪時(shí)間內(nèi)，死亡患者不足一半，中位生存期尚未成熟；1年DFS和LRFS均為100.0%，2年DFS為100.0%，2年LRFS為92.2%。

圖1 全部患者總體生存曲線

2.2.3CTC ERCC1表達(dá)量對(duì)患者生存的影響 誘導(dǎo)化療前，H-ERCC1組、M-ERCC1組、L-ERCC1組1年OS均為100.0%，2年OS分別為：95.2%、97.6%、100.0%，兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ERCC1表達(dá)強(qiáng)度并不影響患者生存。放療前H-ERCC1組、M-ERCC1組、L-ERCC1組1年OS均為100.0%，2年OS分別為：90.4%、92.8%、100.0%，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)果提示：經(jīng)誘導(dǎo)化療后，ERCC1基因不同表達(dá)強(qiáng)度明顯影響患者生存，低表達(dá)或不表達(dá)者預(yù)后最好；中表達(dá)次之，而高表達(dá)者預(yù)后最差。放化療后，H-ERCC1組、M-ERCC1組、L-ERCC1組1年OS均為：85.7%、90.5%、100.0%，2年OS分別為：80.9%、85.7%、100.0%。高表達(dá)者分別與低表達(dá)和中表達(dá)者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而低表達(dá)和中表達(dá)者生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；結(jié)果提示：在完成標(biāo)準(zhǔn)的放化療治療后，ERCC1仍有高表達(dá)者預(yù)后最差，低表達(dá)或不表達(dá)者及中度表達(dá)者不影響患者預(yù)后。見圖2。

圖2 誘導(dǎo)化療前ERCC1不同表達(dá)強(qiáng)度患者生存曲線

3 討 論

鼻咽癌為華南地區(qū)最為常見的腫瘤之一；局部晚期鼻咽癌患者占初治鼻咽癌比例較高，其易局部浸潤(rùn)、常伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高等特點(diǎn)使其療效仍難令人滿意，局部晚期鼻咽癌患者的治療仍沒有明顯突破，臨床預(yù)后仍較差，目前基于影像學(xué)診斷的腫瘤TNM分期難以發(fā)現(xiàn)及提示早期的微轉(zhuǎn)移灶；對(duì)腫瘤患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估是目前CTC臨床應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域，惡性腫瘤患者治療前后的CTC類型和數(shù)目的變化具有重要的預(yù)后提示價(jià)值。實(shí)驗(yàn)證明CTC的出現(xiàn)與晚期癌癥患者的預(yù)后密切相關(guān)〔5〕，CTC檢測(cè)可隨時(shí)獲取用于評(píng)估患者的預(yù)后。此外，CTC是游離于患者血液中的腫瘤細(xì)胞，攜帶了腫瘤的全部基因，可以作為基因檢測(cè)的樣本，通過對(duì)獲取的CTC進(jìn)行基因分析，能實(shí)時(shí)反映腫瘤的基因狀況，清楚地指導(dǎo)患者下一步的藥物選擇，提高治療效果。局部晚期鼻咽癌患者所占新診斷鼻咽癌患者約75%，以鉑類為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)化療及鉑類同步放化療已成為局部晚期患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方式〔6〕；在以鉑類為基礎(chǔ)的化療治療的腫瘤類型中，ERCC1的表達(dá)是腫瘤對(duì)順鉑耐藥的關(guān)鍵因素；研究表明〔7,8〕，ERCC1不僅參與腫瘤細(xì)胞的耐藥過程，還參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡的過程。謝玲等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，石蠟標(biāo)本ERCC1基因的表達(dá)量明顯高于外周靜脈中ERCC1基因的表達(dá)，且兩者呈正相關(guān)，通過外周血檢測(cè)ERCCl基因的表達(dá)一樣可以用來研究與癌癥患者臨床特征及放化療療效的關(guān)系。

本研究中局部晚期患者占大部分，提示合適強(qiáng)度的誘導(dǎo)化療有助于降低ERCC1的陽(yáng)性表達(dá)率而改善患者的預(yù)后，這一結(jié)論在后期隨訪的結(jié)果可以印證。誘導(dǎo)化療后以順鉑為基礎(chǔ)的同步放化療是局部晚期鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案；經(jīng)過誘導(dǎo)化療及同步放化療后，治療前的不同CTC ERCC1陽(yáng)性表達(dá)率的患者生存無差異；提示局部晚期患者CTC中ERCC1水平表達(dá)并不能判斷預(yù)后；但是，經(jīng)過合適的誘導(dǎo)化療后的患者，ERCC1低陽(yáng)性表達(dá)率患者預(yù)后最好。ERCC1的表達(dá)與多種腫瘤的放射抗拒相關(guān)，其基礎(chǔ)理論認(rèn)為：ERCC1過表達(dá)可使停滯在G2/M期的損傷DNA得到迅速修復(fù)，而停滯在G2/M期的細(xì)胞為放療敏感期〔10〕；這一點(diǎn)在本研究也得到證實(shí)，隨訪結(jié)果提示：放療前高表達(dá)的ERCC1陽(yáng)性率同步放化療后預(yù)后最差；所有患者在完成全部治療后，仍有6例患者CTC中ERCC1高表達(dá)而預(yù)后最差；此外，中度表達(dá)、低表達(dá)或不表達(dá)者預(yù)后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，綜合本研究隨訪結(jié)果分析，鼻咽癌患者CTC中ERCC1的表達(dá)可提示放化療療效，而不同療效影響患者生存。

對(duì)于局晚期鼻咽癌高危患者，在標(biāo)準(zhǔn)治療后，是否需要繼續(xù)輔助化療仍爭(zhēng)議較大〔11〕，本研究隨訪結(jié)果對(duì)此有一定的提示意義，鼻咽癌治療失敗大部分是因?yàn)榘l(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞是引起遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要因素；在完成標(biāo)準(zhǔn)治療方案后外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞仍存在并高表達(dá)ERCC1的患者；可以認(rèn)定為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移高風(fēng)險(xiǎn)患者，因此，對(duì)于這一部分患者，理論上是需要后續(xù)輔助化療以降低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率。結(jié)合本研究隨訪結(jié)果認(rèn)為：在患者全程治療過程中關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)CTC的數(shù)量及其ERCC1的表達(dá)率，可以篩選出遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移高風(fēng)險(xiǎn)的患者，并可以提示患者治療的預(yù)后，對(duì)于此類高?；颊邞?yīng)繼續(xù)輔助化療以降低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率。但本研究樣本量較少，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以證實(shí)研究結(jié)果。