BDNF失平衡與中老年T2DM患者葡萄糖代謝和認知損害相關(guān)性

熊靜 李舒婷 邢維昊 張曉琳 劉鳳 巫曉宇

(昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，云南 昆明 650101)

2型糖尿病(T2DM)、認知功能障礙和癡呆是非常普遍的慢性疾病，60歲以上的T2DM患者中癡呆比例高達20%〔1〕。T2DM與阿爾茨海默病(AD)、血管性癡呆和輕度認知障礙的病程進展有關(guān)〔2〕。值得注意的是，糖尿病也是癡呆患者的常見共病，癡呆患者合并糖尿病的比例為13%～39%〔3〕，而認知障礙也會惡化T2DM的管理。到2050年，預計中國癡呆患者將達到4 000萬〔4,5〕。由于糖尿病和認知障礙間的密切聯(lián)系，在今后的10～15年間，糖尿病對癡呆發(fā)病率的影響將日趨明顯〔6〕。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在大腦不同區(qū)域合成和表達〔7〕，也存在于周圍神經(jīng)淋巴細胞、內(nèi)分泌系統(tǒng)、胰腺、內(nèi)皮細胞和脂肪組織中〔8,9〕。BDNF在T2DM胰島素抵抗和認知障礙中有重要作用〔10，11〕，BDNF參與調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和胰島素抵抗，參與胰島素信號通路激活，包括磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(Akt)等〔11〕。BDNF與神經(jīng)元存活、突觸可塑性、學習和記憶密切相關(guān)。BDNF在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中先合成BDNF前體蛋白(proBDNF)，proBDNF在細胞內(nèi)和細胞外經(jīng)過一系列蛋白酶剪切形成成熟型BDNF(mBDNF)〔7,12〕。近年來的研究表明，proBDNF/mBDNF通路平衡對神經(jīng)元可塑性和持續(xù)更新有重要作用，proBDNF和mBDNF失平衡，與AD、血管性癡呆、帕金森病等神經(jīng)變性疾病密切相關(guān)〔12,13〕。mBDNF分泌減少和proBDNF增加是AD和抑郁的共同致病因素〔14〕。本課題組的前期研究〔15〕采用高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6小鼠誘導建立T2DM的小鼠模型，小鼠腦內(nèi)proBDNF上調(diào)，與血糖水平和與小鼠記憶損傷呈負相關(guān)；小鼠腦內(nèi)mBDNF下調(diào)，與血糖水平和小鼠記憶損傷呈負相關(guān)，提示proBDNF和mBDNF失平衡是T2DM認知損傷的可能機制。

研究發(fā)現(xiàn)肥胖、T2DM、癡呆患者血漿中BDNF表達水平降低〔16〕。Passaro等〔17〕注意到T2DM和癡呆患者組的血漿BDNF水平顯著低于非糖尿病癡呆患者組。T2DM損害學習和記憶的部分原因是通過下調(diào)BDNF表達，改變了突觸可塑性〔18〕。目前還沒有研究報道T2DM患者血漿中內(nèi)proBDNF和mBDNF改變與T2DM認知損傷的關(guān)系。本研究分析proBDNF和mBDNF與T2DM患者胰島素抵抗、炎性反應和認知損傷的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2019年12月至2020年12月就診于昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的患者，年齡≥45歲，性別不限，T2DM診斷根據(jù)《中國2型糖尿病防治指南》〔19〕。采用蒙特利爾認知評定(MoCA)量表進行總體認知功能篩查，MoCA<26分，認為有認知損害。根據(jù)有無T2DM和認知障礙，分為3組：對照組(無T2DM+無認知障礙)39例、T2DM組26例、T2DM伴有認知障礙組27例。排除大面積腦梗死、腦出血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病、腦腫瘤、腦外傷、神經(jīng)梅毒、獲得性免疫缺陷綜合征(艾滋病)患者。排除甲狀腺疾病、甲狀旁腺疾病及維生素及其他元素缺乏癥。排除精神分裂癥、酒精及藥物濫用。排除本研究開始1個月內(nèi)使用過影響認知功能的藥物。排除合并感染、嚴重的循環(huán)、呼吸、泌尿、消化、造血系統(tǒng)疾病及惡性疾病者。排除視聽障礙不能完成檢查者。排除冠心病和高血壓患者。3組年齡、性別構(gòu)成、受教育年限無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 3組基線資料比較〔M(Q1～Q3)〕

1.2主要試劑 人proBDNF雙抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國R&D Systems，Cat No.DY3175)，mBDNF ELISA試劑盒(澳大利亞南澳大學周新富教授贈送)。

1.3一般變量評估 使用結(jié)構(gòu)性問卷，收集患者一般信息，包括性別、年齡、教育程度。

1.4血漿proBDNF和mBDNF濃度 清晨空腹肘靜脈采血，5 000 r/min離心5 min，分離血漿，凍于-80℃?zhèn)溆?。采用ELISA測定血漿中proBDNF和mBDNF濃度。proBDNF 測定根據(jù)說明書進行。mBDNF ELISA測定簡述如下〔15,20〕：G 蛋白純化的小鼠抗-mBDNF 單克隆抗體(工作濃度1 μg/ml)包被酶標板,37℃ 1 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗板,3%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h。加樣:標準品為重組mBDNF 蛋白,倍比稀釋加入,范圍0～2 000 pg/ml,每孔加入血漿100 ml或淋巴細胞提取蛋白，37℃,1 h,磷酸鹽Tween-20緩沖液(PBST)洗板,加入檢測抗體——生物素標記的羊抗mBDNF 抗體(工作濃度0.15 μg/ml),37℃,1 h。PBST 洗板,加入辣根過氧化物酶標記鏈霉素親和素(Streptavidin-HRP)37℃,1 h,PBST洗板,加入新鮮配制的3，3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物,室溫避光,10～15 min 內(nèi)顯色。加入0.1 mol/L HCL 終止反應,用Model 2550 EIA reader 于450 nm 讀取OD 值。

1.5血漿葡萄糖、胰島素水平測定 清晨空腹采集靜脈血，測定糖化血紅蛋白、空腹血糖和空腹胰島素。之后，口服葡萄糖粉75 g(溶解于300 ml水中)后，測定60 min、120 min時的靜脈血漿葡萄糖和胰島素水平。胰島素抵抗評價采用穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR=胰島素濃度×空腹血糖/22.5)。

1.6血漿炎癥因子測定 清晨空腹采集靜脈血，測定血常規(guī)(白細胞、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞和血小板計數(shù))，C反應蛋白(CRP)和白細胞介素(IL)-6。

1.7認知功能評定

1.7.1韋氏記憶量表測定 ①圖片回憶、視覺再認、視覺再生、聯(lián)想學習、觸覺記憶及邏輯記憶反映短時記憶力。②順背數(shù)字、倒背數(shù)字及順背+倒背數(shù)字反映瞬時記憶力。③圖片回憶、聯(lián)想學習及邏輯記憶反映注意力。④聯(lián)想學習和邏輯記憶反映理解記憶力。⑤視覺再生和觸覺記憶反映視空間能力。⑥倒背數(shù)字、視覺再生及觸覺記憶反映執(zhí)行功能。⑦邏輯記憶還可以反映情景記憶和語言理解。

1.7.2連線試驗A、B測驗 主要測定執(zhí)行能力、注意力和注意轉(zhuǎn)換能力，連線試驗A、B及(B-A)耗時越長，此項能力越差〔21〕。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS23.0軟件進行Kruskal-WallisH檢驗、Mann-WhitneyU檢驗、Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1血漿中proBDNF和mBDNF濃度 與對照組相比，T2DM組和T2DM伴認知障礙組血漿proBDNF增加，T2DM伴認知障礙組最顯著(P<0.01)。相反，T2DM組和T2DM伴認知障礙組血漿mBDNF顯著下降，T2DM伴認知障礙組最顯著(P=0.00)。見表2。

2.23組葡萄糖代謝指標比較 與對照組相比，T2DM組和T2DM伴認知障礙組空腹血糖、糖化血紅蛋白、餐后2 h血糖、空腹胰島素和HOMA-IR水平組明顯升高(P<0.05)，T2DM伴認知障礙組升高最顯著。見表2。

2.3炎癥指標的差異 與對照相比，T2DM組和T2DM伴認知障礙組的單核細胞計數(shù)、IL-6、CRP水平均明顯升高(均P<0.05)，提示T2DM時，炎癥反應增加。見表2。

表2 各組葡萄糖代謝結(jié)果指標〔M(Q1～Q3)〕

2.4血漿proBDNF、mBDNF水平和糖代謝指標的相關(guān)性 血漿proBDNF水平與餐后2 h血糖呈正相關(guān)(P<0.05)，血漿mBDNF與餐后2 h血糖、糖化血紅蛋白呈負相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 血漿和淋巴細胞中proBDNF、mBDNF水平與糖代謝指標的相關(guān)性

2.5proBDNF和mBDNF與炎性因子的相關(guān)性 proBDNF水平與單核細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)及IL-6呈正相關(guān)(均P<0.05)。mBDNF與單核細胞計數(shù)呈負相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 血漿proBDNF和mBDNF水平與炎癥的相關(guān)性

2.6認知功能評價

2.6.1總體認知評價 對照組MoCA評分為28(27～30)分，T2DM組MoCA評分為28(27～29)分，與對照組比較，T2DM伴認知障礙組MoCA總分〔23(21～23)分〕顯著下降(Z=91.9，P<0.001)。

2.6.2韋氏記憶量表評價 與對照組相比，T2DM伴有認知障礙組圖片回憶、視覺再認、視覺再生、聯(lián)想學習、理解記憶、順背數(shù)字、倒背數(shù)字和順背+倒背數(shù)字測試得分均顯著下降(P<0.05)。T2DM組圖片回憶、視覺再認、理解記憶和順背+倒背總分明顯低于對照組(均P<0.05)。見表5。

表5 3組韋氏記憶測定分量表評分比較〔M(Q1～Q3)，分〕

2.6.3連線試驗 與對照組相比，T2DM組、T2DM評認知障礙組連線A、B耗時和連線(B-A)耗時差更長(P<0.05)，T2DM伴有認知障礙組耗時最長(均P<0.05)。見表6。

表6 3組連線試驗結(jié)果比較〔M(Q1～Q3)，s〕

2.7血漿proBDNF和mBDNF水平與認知功能的相關(guān)性 血漿proBDNF和MocA總分、圖片回憶、視覺再認、理解記憶、順指數(shù)字、倒背數(shù)字、順背+倒背數(shù)字呈負相關(guān)，與連線試驗呈正相關(guān)，mBDNF和MocA總分、圖片回憶、視覺再認、視覺再生、聯(lián)想學習、理解記憶、順倒背數(shù)字呈正相關(guān)，與連線A耗時、連線B耗時、連線(B-A)耗時呈負相關(guān)(P<0.05，P<0.01)。見表7。

3 討 論

BDNF在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中先合成proBDNF，在細胞內(nèi)由furin蛋白酶酶切成mBDNF。proBDNF和mBDNF存儲在突觸前膜致密囊泡中，通過特定方式分泌到細胞外。分泌到細胞外的proBDNF由組織纖維蛋白溶解酶(tPA)或基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)酶切形成mBDNF〔12〕。ProBDNF和mBDNF分別與p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體(p75NTR)和酪氨酸激酶受體B (TrkB)結(jié)合，對神經(jīng)元存活、突觸可塑性，學習和記憶起著相反的生物學作用〔7,12，13〕。

有研究表明，肥胖、T2DM、神經(jīng)退行性疾病患者血清中BDNF水平較低〔22〕。既往的研究表明，T2DM患者長期存在的胰島素抵抗和慢性高胰島素血癥，引起大腦胰島素信號失調(diào)和葡萄糖代謝障礙，會促進Aβ和NFTs形成、皮層和海馬神經(jīng)元丟失、乙酰膽堿下降，損害學習和記憶〔23〕。本研究與之前的研究結(jié)果〔11〕一致，T2DM合并認知障礙組的空腹和餐后血糖水平最高，空腹胰島素水平最高，HOMA-IR顯示胰島素抵抗水平最高。先前的研究表明，BDNF在胰島素抵抗和能量平衡中起作用〔11〕。本研究結(jié)果提示proBNDF和mBDNF失平衡與T2DM持續(xù)的高血糖水平和餐后2 h血糖有關(guān)，進而對T2DM患者的認知功能產(chǎn)生影響。

全身炎癥反應與胰島素抵抗、T2DM動脈粥樣硬化之間存在關(guān)聯(lián)〔11〕，炎癥反應也被認為與各種癡呆類型有關(guān)；與之前的研究〔11〕結(jié)論一致。之前的研究也發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥狀態(tài)、免疫系統(tǒng)增強和循環(huán)中炎癥細胞因子改變與BDNF表達有關(guān)〔11〕。既往研究顯示，在活化的抗原特異性T細胞和B細胞中，單核細胞產(chǎn)生BDNF和IL-6〔24〕。既往的研究表明，在多種炎癥性疾病中，proBDNF 信號在單核細胞、巨噬細胞或小膠質(zhì)細胞中激活，對炎癥反應有強烈的誘導作用，如脊髓損傷小鼠模型中，proBDNF可以通過調(diào)節(jié) ED1+巨噬細胞的浸潤和遷移加重脊髓損傷。弓形體腦炎中，單核/巨噬細胞中的 proBDNF信號參與了外周免疫細胞進入大腦的過程。本研究結(jié)果提示，T2DM患者存在的炎癥反應與proBDNF和mBDNF失平衡相關(guān)，可能與T2DM的糖代謝障礙和認知損傷相關(guān)。

BDNF被認為與神經(jīng)變性疾病密切相關(guān)。先前的研究發(fā)現(xiàn)了BDNF可以透過血腦屏障〔25〕。血清和皮層BDNF水平呈高度正相關(guān)〔26〕。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者的血漿BDNF水平降低〔27〕，與大腦海馬BDNF表達降低相一致。既往的研究顯示，T2DM患者血清BDNF 濃度與延遲記憶損傷相關(guān)〔16〕。有一些研究證實了包括抑郁〔14〕、AD、腦外傷、酒精依賴等神經(jīng)精神疾病，與外周 proBDNF水平改變密切相關(guān)〔20,28～30〕。前期研究發(fā)現(xiàn)了重癥抑郁患者外周血proBDNF與抑郁評分正相關(guān)〔14〕。

已有研究證實，proBDNF/mBDNF平衡對神經(jīng)元可塑性和神經(jīng)元連續(xù)更新有重要作用〔12〕。與多種神經(jīng)退行性疾病，包括衰老、AD〔31〕和艾滋病相關(guān)癡呆〔32〕相關(guān)。mBDNF通過與TrkB結(jié)合，促進神經(jīng)元的存活、增加突觸可塑性，促進記憶〔13〕。proBDNF是一個強大的神經(jīng)退行性疾病促進因子，通過激活p75NTR和sortilin受體復合物，顯著抑制神經(jīng)干細胞增殖、減少神經(jīng)元分化、引起神經(jīng)突起塌陷、神經(jīng)元凋亡和抑制神經(jīng)發(fā)生〔33〕，從而損害認知功能〔7,12〕。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，血清proBDNF與腦內(nèi)磷酸化的Tau蛋白呈正相關(guān)〔34〕。目前的研究結(jié)果表明proBDNF/mBDNF失平衡可能促進了T2DM認知障礙的進展。

T2DM認知障礙的機制是復雜的，存在著胰島素抵抗、腦小血管損傷、血腦屏障滲漏、炎癥和氧化應激等共同的病理生理機制〔35〕。結(jié)果，T2DM時，proBDNF和mBDNF失平衡可能是T2DM患者胰島素抵抗和認知障礙的共同分子機制。本研究結(jié)果提示，升高的血糖水平、全身炎癥狀態(tài)、改變的循環(huán)炎癥細胞因子與BDNF失平衡相關(guān)，這需要在未來的研究中得到證實。由于外周血易獲得，本研究結(jié)果也將提示，proBNDF/mBDNF可否成為 T2DM 認知障礙發(fā)展的重要的生物學標記，為疾病監(jiān)測提供依據(jù)。

既往對抑郁研究表明，調(diào)節(jié)proBDNF和mBDNF平衡，與癥狀改善相關(guān)。運動和電休克可以提高海馬區(qū)furin、tPA和MMP-9的水平，增加proBDNF轉(zhuǎn)化為mBDNF，可以減輕小鼠的抑郁樣行為〔36，37〕。既往的研究得出，運動〔38〕和限制飲食〔39〕可以提高BDNF水平，增加神經(jīng)元對損傷的耐受性，同時改善肥胖、T2DM和認知功能，提高空間學習和記憶。本研究進一步提出，調(diào)整血糖水平，特別是餐后血糖水平，可能改善proBDNF和mBDNF的失平衡，從而改善T2DM的認知損傷。

根據(jù)目前的研究結(jié)果，推測proBDNF與mBDNF失平衡，可能通過不同通路，在神經(jīng)元網(wǎng)絡調(diào)節(jié)效應和能量消耗的穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮不同作用，但具體作用機制有待繼續(xù)研究。研究結(jié)果也提示，探索調(diào)節(jié)T2DM時proBDNF和mBDNF的生物合成過程，如改變飲食和運動，增加mBDNF正性作用或降低proBDNF負性作用，可能為開發(fā)新的治療方法提供機會。