電動(dòng)-微生物協(xié)同處理含油污泥

譙夢(mèng)丹，馬麗麗，楊冰，劉宇程，周密

(1.西南石油大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，四川 成都 610500； 2.西南石油大學(xué) 工業(yè)危廢處置與資源化利用研究院，四川 成都 610500)

含油污泥是原油在開(kāi)采、運(yùn)輸、儲(chǔ)存過(guò)程中產(chǎn)生的一種污染物[1]。其成分極其復(fù)雜，包含重金屬、老化原油、多環(huán)芳烴及鹽類等[2]，是《國(guó)家危險(xiǎn)廢物名錄》HW08類危廢物[3-4]。這類有毒物質(zhì)對(duì)人體健康和生態(tài)系統(tǒng)平衡存在巨大的影響[5]。因此，針對(duì)含油污泥處理技術(shù)的研究已迫在眉睫。目前，電場(chǎng)強(qiáng)化微生物技術(shù)多用于土壤中石油烴的降解，而利用該技術(shù)處理含油污泥的研究并不多見(jiàn)[6-7]。本研究從某油田的含油鉆屑中篩選出2株石油烴降解能力較強(qiáng)的菌株，研究電場(chǎng)強(qiáng)化微生物技術(shù)對(duì)含油污泥的處理效果，以期為含油污泥的處理提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

本研究使用的菌株篩選自含油鉆屑；含油污泥，取自某石油化工企業(yè)的清罐油泥，含油污泥的理化性質(zhì)見(jiàn)表1，將其風(fēng)干、粉碎后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

CS-700高速多功能粉碎機(jī)；LC-LX-H1850臺(tái)式高速離心機(jī)；SB-4200 DTD超聲波清洗機(jī)；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋；THZ-92A恒溫振蕩器；UV-1900i紫外分光光度計(jì)；TD1326可調(diào)直流穩(wěn)壓電源；MGC-250光照培養(yǎng)箱；OIL480低濃度石油類紅外測(cè)油儀；PHS-3C pH計(jì)。

表1 含油污泥理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of oily sludge

1.2 培養(yǎng)基制備

實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基如下，所有培養(yǎng)基的pH均調(diào)整為7.0～7.5，并在121 ℃、1×105Pa下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.1 LB培養(yǎng)基 酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L。

1.2.2 原油液體培養(yǎng)基 原油5 g/L、NaCl 5 g/L、 MgSO4·7H2O 0.5 g/L、(NH4)2SO41 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L、CaCl20.5 g/L。

1.2.3 原油固體培養(yǎng)基 原油5 g/L、NaCl 5 g/L、 MgSO4·7H2O 0.5 g/L、(NH4)2SO41 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L、CaCl20.5 g/L、瓊脂20 g/L。

1.2.4 柴油液體培養(yǎng)基 柴油5 g/L、NaCl 5 g/L、 MgSO4·7H2O 0.5 g/L、(NH4)2SO41 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L、CaCl20.5 g/L。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 石油烴降解菌的篩選 取10 g含油鉆屑接入150 mL的無(wú)菌水中，在35 ℃、150 r/min條件下，放入搖床振蕩30 min后，移取1 mL的懸液加入到LB培養(yǎng)基中，在上述相同條件下培養(yǎng)48 h。然后，將富集的菌懸液移取1 mL轉(zhuǎn)移至原油液體培養(yǎng)基中，在上述相同條件下培養(yǎng)48 h，重復(fù)3次后，將富集菌懸液按一定梯度稀釋后，將稀釋液接入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，從平板上挑取形態(tài)不一的菌株進(jìn)行劃線、分離，得到長(zhǎng)勢(shì)好的單菌，再將單菌接種到原油液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行復(fù)篩培養(yǎng)，最終篩選出5株降解菌(編號(hào)為S1～S5)。

1.3.2 菌株的降解能力 篩選出的5株菌株經(jīng)過(guò)活化后，將菌液分別接種到100 mL的柴油液體培養(yǎng)基中，放入搖床培養(yǎng)7 d后，將培養(yǎng)基倒入分液漏斗，加入正己烷萃取柴油，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定萃取液中的柴油的含量。柴油降解率按式(1)計(jì)算。

(1)

式中D——柴油降解率，%；

C0——處理前柴油含量，mg/L；

C1——處理后柴油含量，mg/L。

1.3.3 菌株的鑒定 本研究將篩選出的兩株菌株保藏在甘油中委托生工生物公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，所得結(jié)果經(jīng)NBCI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，挑選相關(guān)序列，采用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，鑒定菌屬。

1.3.4 含油污泥處理實(shí)驗(yàn) 如圖1所示，電動(dòng)裝置由有機(jī)玻璃板組成。反應(yīng)室長(zhǎng)20 cm、寬10 cm、高10 cm，電極室長(zhǎng)10 cm、寬10 cm、高12 cm。電場(chǎng)強(qiáng)化微生物處理含油污泥實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)室中進(jìn)行。為了防止污泥進(jìn)入電解室，在反應(yīng)室和電解室中間放入濾紙。兩碳板采用平行方式放入電解室中，電解液成分(單位是g/L)是NaNO3：1.5，(NH4)2SO4：1.5，MgSO4·7H2O：0.5，KCl：0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O：0.01，CaCl2：0.002，每3 d換1次電解液。本研究設(shè)置3個(gè)處理組，其中電動(dòng)微生物組(EKBio)為施加電場(chǎng)并加入降解菌(每株菌加量為2.5%，v∶w)；電動(dòng)力學(xué)組(EK)為只施加電場(chǎng)；微生物組(Bio)則只添加降解菌(每株菌加量為2.5%，v∶w)。每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)反應(yīng)器500 g含油污泥。根據(jù)含油污泥中的碳、氮、磷比，以NH4Cl作為氮源，添加到污泥中，使C∶N∶P約為100∶10∶1。每隔12 h切換電極，電壓梯度為1 V/cm，實(shí)驗(yàn)處理周期為20 d，將反應(yīng)室分為初始陽(yáng)極、中間、初始陰極三個(gè)區(qū)域，每次分別從三個(gè)區(qū)域取樣。EKBio、EK、Bio三個(gè)處理組分別在第0天和第20天進(jìn)行取樣，另外對(duì)EKBio處理組在第4天和第12天進(jìn)行取樣，所有樣品保存至4 ℃冰箱中待測(cè)。采用紅外分光光度法(HJ 1051—2019)測(cè)定含油污泥中石油烴的含量，計(jì)算出總石油烴(TPH)的降解率。在本研究中，EKBio處理組和EK處理組的TPH總降解率是初始陽(yáng)極、中間和初始陰極附近TPH降解率的平均值，而B(niǎo)io處理組的TPH總降解率是3組平行實(shí)驗(yàn)TPH降解率的平均值，而每個(gè)組的TPH降解率是由三個(gè)區(qū)域附近的污泥混合為一個(gè)樣進(jìn)行測(cè)定得到。

圖1 電動(dòng)裝置圖Fig.1 Schematic of the electrokinetics setup

2 結(jié)果與討論

2.1 石油烴降解菌的篩選及鑒定

2.1.1 菌株的篩選 篩選出的S1～S5菌株對(duì)柴油均具有一定的降解作用，其中S1和S2對(duì)柴油的降解率較高，分別為27.53%和48.22%(表2)。因此，選定菌株S1和S2用于后續(xù)電場(chǎng)強(qiáng)化微生物技術(shù)處理含油污泥實(shí)驗(yàn)。

表2 菌株S1～S5對(duì)柴油的降解率Table 2 Degradation rate of diesel oil by strains S1～S5

2.1.2 菌株 16S rDNA 的鑒定 將S1、S2菌株分別命名為PCY、PCW。PCY 的 16S rDNA 序列與Pseudomonasstutzeristrain CCUG 11256(登錄號(hào) NR_118798.1)有99%的相似度；PCW的16S rDNA序列與Klebsiellaoxytocastrain ATCC 13182(登錄號(hào)NR_118853.1)有99%的相似度，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，表明PCY菌為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，PCW菌為克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)。

圖2 菌株P(guān)CY、PCW的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 The 16S rDNA phylogenetic tree of strains PCY and PCW

2.2 含油污泥中石油烴的降解

2.2.1 不同處理方式對(duì)石油烴降解的影響 不同處理方式下含油污泥中總石油烴(TPH)的降解情況見(jiàn)圖3。

由圖3可知，經(jīng)過(guò)20 d的處理，電動(dòng)微生物組(EKBio)、電動(dòng)組(EK)、微生物組(Bio)的TPH降解率分別為31.25%，14.18%，7.45%。EKBio處理后的TPH降解率明顯高于Bio處理后的TPH降解率，表明電場(chǎng)作用提高了微生物降解石油烴的效率。在EKBio處理中，一方面，電場(chǎng)可能促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在污泥中的均勻分布，同時(shí)進(jìn)一步促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)，加強(qiáng)微生物的新陳代謝[8]，有助于石油烴降解菌的生長(zhǎng)[9]；另一方面，電場(chǎng)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生刺激作用，使其保持較高的酶活性及代謝活性，并且在電場(chǎng)作用下增強(qiáng)了細(xì)菌運(yùn)動(dòng)[10]，促使微生物能夠更快地降解石油烴，顯著縮短處理周期。此外，在電滲透作用下石油烴也會(huì)從陽(yáng)極運(yùn)動(dòng)到陰極，從而提高了其生物利用度[9]。EK處理后的TPH降解率低于EKBio處理后的TPH降解率，并且EK處理組在不同區(qū)域的TPH降解率均低于EKBio處理組在不同區(qū)域的TPH降解率(圖4)，這也表明加入外源微生物能夠有效提高EK處理含油污泥的效率。在EK和EKBio處理中，兩電極附近的TPH降解率均高于中間附近的TPH降解率，原因可能是在電場(chǎng)條件下，由于水分子和含油污泥表面相互作用，產(chǎn)生水向陰極流動(dòng)的電滲透，在轉(zhuǎn)換電極作用下，這種水流裹挾石油烴向兩極移動(dòng)，最終在電氧化作用下石油烴被降解[10]，而在EKBio處理中，外源降解菌會(huì)在電滲透和電遷移作用下向兩極移動(dòng)，降解菌與污染物之間的接觸程度增大[11]，使得EKBio處理組中兩電極附近的TPH降解率明顯高于EK處理組中兩電極附近的TPH降解率，證明了電場(chǎng)強(qiáng)化微生物的積極作用。

圖3 電動(dòng)、微生物及其聯(lián)合處理對(duì)TPH降解率的影響Fig.3 Effects of electrokinetics，bioremediation and combined treatment on TPH degradation rate

圖4 電動(dòng)微生物、微生物處理后 不同區(qū)域的TPH降解率Fig.4 Effects of electro-bioremediation and bioremediation on TPH degradation rate in different areas

2.2.2 電場(chǎng)強(qiáng)化微生物技術(shù)處理含油污泥的效果 在周期性極性反轉(zhuǎn)的方式下，采用電場(chǎng)強(qiáng)化微生物技術(shù)對(duì)含油污泥進(jìn)行20 d的處理，處理過(guò)程中初始陽(yáng)極、中間、初始陰極附近含油污泥的石油烴降解率變化見(jiàn)圖5。

圖5 電場(chǎng)強(qiáng)化微生物處理含油污泥過(guò)程中 不同區(qū)域的TPH降解率Fig.5 Effect of electro-bioremediation on TPH degradation rate in different areas

由圖5可知，在EKBio處理過(guò)程中，隨著處理時(shí)間的增加，TPH的總降解率呈上升趨勢(shì)，且兩電極附近的TPH降解率明顯高于中間附近的TPH降解率。這可能是因?yàn)殛?yáng)極附近活性自由基的產(chǎn)生，以及自由基隨后擴(kuò)散到含油污泥中，可將石油烴氧化為部分微生物易降解的產(chǎn)物[12-13]。此外，在電場(chǎng)作用下，降解菌向兩極移動(dòng)[11]，使得兩電極附近的TPH降解率高于中間附近的TPH降解率。與本研究的結(jié)果相似，Li等[14]研究極性反轉(zhuǎn)電動(dòng)強(qiáng)化生物降解對(duì)芘污染土壤的影響，發(fā)現(xiàn)極性反轉(zhuǎn)后兩電極附近的芘降解率高于中間部分的芘降解率。而Wei等[15]研究電極極性反轉(zhuǎn)對(duì)含菲粘土生物修復(fù)的影響，結(jié)果表明使用電極極性反轉(zhuǎn)對(duì)菲有更高的去除率，其中中間附近的菲去除率高于兩極附近的菲去除率。由此可見(jiàn)電極轉(zhuǎn)換對(duì)不同電極區(qū)域的污染物降解的影響較為復(fù)雜，可能與轉(zhuǎn)換電極的周期以及污染物種類和取樣時(shí)間有關(guān)。

2.2.3 電場(chǎng)強(qiáng)化微生物技術(shù)處理含油污泥的降解速率 由圖6可知，電場(chǎng)強(qiáng)化微生物處理過(guò)程中TPH的降解速率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在0～4 d，石油烴的降解速率最快，這可能是因?yàn)榇罅客庠次⑸锛尤牒臀勰?，開(kāi)始以石油烴作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，并且在電場(chǎng)刺激下，微生物保持較高的代謝活性[10]，兩者的聯(lián)合作用使得TPH降解速率最高。在4～12 d和12～20 d，石油烴降解速率持續(xù)下降，可能是由于氮源、磷源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和缺乏，使得微生物新陳代謝速度下降，影響微生物降解石油烴的能力[9]。一些中間有毒產(chǎn)物的產(chǎn)生也會(huì)影響微生物降解石油烴的速率[16]。此外，中間區(qū)域的石油烴降解速率最低，可能是因?yàn)槲⑸镌陔娺w移和電滲透的作用下向著兩極遷移[17]，有助于降解兩極的石油烴，從而使得中間區(qū)域的石油烴降解速率小于兩電極的降解速率。

圖6 電場(chǎng)強(qiáng)化微生物處理含油污泥過(guò)程中的降解速率Fig.6 Degradation rate of oily sludge treated by electro-bioremediation

2.3 含油污泥pH的變化

含油污泥的pH值對(duì)微生物高效降解有機(jī)污染物至關(guān)重要[14]。當(dāng)直流電場(chǎng)作用于含油污泥時(shí)，水在電極處發(fā)生電解作用，陽(yáng)極產(chǎn)生H+，陰極產(chǎn)生OH-，陽(yáng)極和陰極附近的含油污泥會(huì)出現(xiàn)極端pH[18]。因此，本研究利用極性反轉(zhuǎn)的方式進(jìn)行處理，EKBio處理組在處理20 d后的含油污泥pH仍保持在7～8之間(圖7)，這是由于當(dāng)逆轉(zhuǎn)電極的極性時(shí)，電極上產(chǎn)生的H+和OH-會(huì)被中和，使得含油污泥pH值能夠保持穩(wěn)定[6]，從而避免對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝的影響，有助于石油烴的降解。

圖7 電場(chǎng)強(qiáng)化微生物處理含油污泥過(guò)程中污泥pH值的變化Fig.7 Changes of soil pH value during the treatment of oily sludge by electro-bioremediation

3 結(jié)論

(1)本研究從含油鉆屑中篩選出兩株石油烴降解菌，經(jīng)鑒定菌株P(guān)CY為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，菌株P(guān)CW為克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)。

(2)將降解菌與電動(dòng)相結(jié)合用于處理含油污泥，其石油烴降解率為31.25%，明顯高于單獨(dú)電動(dòng)處理(14.18%)和單獨(dú)微生物處理(7.45%)，表明電動(dòng)與微生物協(xié)同作用于含油污泥中石油烴的降解。