雙重特異性磷酸酶15 基因?qū)岱让艋恼{(diào)控作用

張 茜，王 翌，明 智，朱永生，黨 偉

（1. 寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，寧夏銀川 750001；2. 西安市精神衛(wèi)生中心，陜西西安 710100；3. 西安交通大學醫(yī)學部法醫(yī)學院，陜西西安 710061）

毒品成癮是一種慢性復發(fā)性腦疾病，主要表現(xiàn)為不顧惡性后果的強迫性藥物使用，反復的戒斷和復吸。伏隔核（nucleus accumbens, NAc）是毒品獎賞強化與戒斷引起負性情感的關(guān)鍵核團，參與成癮行為調(diào)控與學習記憶的功能調(diào)節(jié)，是目前臨床治療毒品成癮的靶向腦區(qū)[1]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases, MAPK）家族主要包括3 個亞型：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular-regulated protein kinase, ERK）、c-Jun 氨基末端激酶和 p38 激酶。ERK 在大腦中廣泛表達，尤其在中腦邊緣系統(tǒng)中含量最為豐富，參與了藥物敏化、獎賞、相關(guān)記憶的鞏固、再鞏固及戒斷后藥物尋覓[2]。目前有關(guān)ERK 活化（磷酸化）的機制已進行了較全面的研究，然而有關(guān)ERK 失活（去磷酸化）的機制鮮有報道。

MAPK 失活最有效的機制是由一個或兩個蘇氨酸/酪氨酸殘基快速直接去磷酸化完成。介導MAPK 去磷酸化的主要酶為雙重特異性磷酸酶（dual-specificity phosphatases,DUSPs）超家族。DUSP包括一個蛋白酪氨酸磷酸化酶的亞組即MKP，它可以使MAPK 蘇氨酸/酪氨酸殘基特異性去磷酸化[3]。除了脫磷酸的作用，DUSP 還可以用來錨定或者運輸MAPKs 并且控制他們的亞細胞定位[4]，可作為人類疾病治療的潛在分子靶點[5]。最新研究提示，DUSP15 負性調(diào)控了嗎啡成癮記憶形成及消退[6]。本文旨在研究DUSP15 對小鼠嗎啡敏化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究所有實驗均采用C57BL/6J 雄性小鼠，8 周齡，體質(zhì)量18～25 g，飼養(yǎng)于恒溫（24±2）℃、恒濕（50%～60%）及12 h/12 h（光照時間：7∶00～19∶00）恒定晝夜節(jié)律的SPF 級動物房。所有動物實驗均遵照寧夏醫(yī)科大學實驗動物委員會實驗動物管理和使用條例執(zhí)行。

1.2 藥品、抗體及病毒載體

鹽酸嗎啡購自中國食品藥品檢定研究院（1 mg/mL）。DUSP15 過表達病毒載體（pAAV-CAG-eGFP-2ADUSP15-3FLAG，滴度：3.12×1012vg/mL)及對照病毒(pAAV-CAG-eGFP-2A-MCS-3FLAG，滴度：8.87×1012vg/mL)由和元生物技術(shù)有限公司構(gòu)建合成。兔抗NeuN（貨號：ab177487）及羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor 594；貨號：ab150080)購自英國 Abcam，DAPI 購自北京索萊寶科技有限公司（貨號：C0065）。抗體名稱、貨號、稀釋比例、分子量大小及生產(chǎn)廠家具體信息見表1。

表1 抗體信息Tab. 1 Antibody and virus vector information

1.3 行為學實驗

將小鼠隨機分為2 組，分別為嗎啡組及生理鹽水組，每組10 只。敏化行為過程包括形成期（第1 天-第7 天），轉(zhuǎn)化期（第8 天-第14 天）和表達期（第15 天）三個階段。敏化形成期間嗎啡采用腹腔注射，早晨9∶00 注射生理鹽水，下午 5∶00 注射嗎啡（10 mg/kg），連續(xù)7 d。轉(zhuǎn)化期，停止生理鹽水及嗎啡注射，連續(xù)7 d。表達期，第15 天通過向小鼠腹腔注射1 針嗎啡（10 mg/kg），通過曠場實驗（open field test, OFT）評估敏化效應。

1.4 Western blotting 蛋白定量分析

將小鼠頸椎脫位處死后，分離NAc。提取總蛋白并進行定量，用120 g/L 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白。經(jīng)過轉(zhuǎn)印、脫脂牛奶封閉后，加入一抗，置于搖床，4 ℃孵育過夜。第2 天洗膜后加入二抗（稀釋比為1∶1 000），室溫下置于搖床，孵育70 min。洗膜后用BIO-RAD molecular imager 凝膠成像系統(tǒng)進行蛋白條帶圖像采集，Image Lab 軟件進行蛋白條帶數(shù)據(jù)分析。

1.5 腦立體定位注射實驗

30～50 mL/L異氟烷誘導麻醉小鼠，參照G.Paxinos小鼠腦立體定位圖譜，定位NAc 坐標（AP，+1.4 mm；ML，±2.0 mm；DV，-4.6 mm；10° angle）。根據(jù)該坐標，微量注射器以10°夾角進行NAc 腦區(qū)立體定位注射。兩側(cè)NAc 核團均注射pAAV-CAG-eGFP-2A-DUSP15-3FLAG（AAV-DUSP15）及對照病毒pAAV-CAG-eGFP（AAV-對照），小鼠恢復 5 d，期間連續(xù)注射5 d 青霉素預防感染。

1.6 統(tǒng)計學分析

CPP 數(shù)據(jù)采用雙因素（藥物與時間）重復測量方差分析（two-way repeated measures of ANOVA）結(jié)合Turkey’s 多重檢驗進行比較。蛋白表達數(shù)據(jù)采用非配對t檢驗或雙因素方差分析結(jié)合Turkey’s多重檢驗進行比較。所有計量資料采用mean±SEM 表示，P＜0.05 設置為具有統(tǒng)計學差異閾值。

2 結(jié) 果

2.1 嗎啡敏化小鼠模型的建立及DUSP15 蛋白表達

表達期嗎啡組小鼠活動距離及總活動距離顯著高于鹽水組（P＜0.000 1），表明小鼠慢性暴露嗎啡7 d，經(jīng)過7 d 停藥可誘導嗎啡敏化效應（圖1A、1B、1C）。與鹽水對照組相比，嗎啡組小鼠NAc 中p-ERK 活化水平顯著上調(diào)（P＜0.000 1，圖1D、1E），DUSP15 表達顯著降低（P＜0.001，圖1D、1F）。

圖1 嗎啡小鼠敏化表達期OFT/ERK 磷酸化與DUSP15 表達Fig.1 Phosphorylation of OFT/ERK and expression of DUSP15 in morphine sensitized mice

2.2 過表達小鼠NAc DUSP15對嗎啡敏化及p-ERK活化水平的影響

病毒注射及嗎啡敏化表達檢測實驗流程如圖2A所示，向小鼠 NAc 注射 AAV-DUSP15（圖 2B），3 周后病毒顯著表達（圖2C）。

圖2 小鼠NAc DUSP15 過表達病毒注射及病毒表達Fig.2 Mouse NAc DUSP15 overexpression virus injection and virus expression

向小鼠腹腔注射嗎啡同時向小鼠NAc 注射AAV 對照病毒 pAAV-CAG-eGFP（嗎啡-AAV-對照）或DUSP15 過表達病毒（嗎啡-AAV-DUSP15），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與嗎啡-AAV-對照組相比，嗎啡-AAVDUSP15 組小鼠活動距離顯著降低（P＜0.05，圖3A），總活動距離顯著降低（P＜0.001，圖3B）。與嗎啡-AAV-對照組相比，DUSP15 蛋白表達顯著增高（P＜0.01，圖3C），p-ERK活化水平顯著下調(diào)（P＜0.01，圖3D）。以上表明，小鼠NAc 過表達DUSP15 可以阻止嗎啡敏化形成，且DUSP15 負性調(diào)控了p-ERK 的表達。

圖3 過表達DUSP15 對敏化行為及p-ERK 的調(diào)控作用Fig.3 Regulatory effect of overexpressed DUSP15 on sensitization behavior and p-ERK

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔連續(xù)注射10 mg/kg 嗎啡，停藥1 周可成功誘導小鼠嗎啡敏化行為，NAc 中p-ERK 活化水平上調(diào)，且DUSP15 表達水平降低。過表達NAc 中DUSP15 可以阻止小鼠嗎啡敏化形成，并降低p-ERK 的活化。表明NAc DUSP15 調(diào)控了嗎啡敏化行為，其機制與負性調(diào)控p-ERK 相關(guān)。

NAc 整合前額葉皮質(zhì)，海馬及杏仁核的信息，從而調(diào)節(jié)個體藥物渴求動機行為。NAc 包括“愉悅中樞”，是獎賞-強化系統(tǒng)的主要組成部分，在人類和動物的行為獎賞、強化及藥物成癮發(fā)生發(fā)展過程中起至關(guān)重要作用[7]。

由于MAPK 活化的時間和數(shù)量在細胞信號轉(zhuǎn)導過程中起重要作用，因此MAPK 的激活和失活同樣重要。除了脫磷酸的作用，DUSPs 還可以用來錨定或者運輸MAPK 并且控制他們的亞細胞定位[4]。ERK 在大腦中廣泛表達，尤其在中腦邊緣系統(tǒng)中含量最為豐富，ERK 信號級聯(lián)在獎賞系統(tǒng)過程中的重要作用在藥物成癮形成和發(fā)展中日益受到關(guān)注。采用條件性位置偏愛（conditioned place preference, CPP）模型研究發(fā)現(xiàn)，NAc 中ERK 介導了嗎啡獎賞效應[8]。研究表明，小鼠腹腔連續(xù)5 d 注射可卡因，停藥9 d 可誘導敏化行為，且與NAc 中p-ERK 表達上調(diào)密切相關(guān)[9]。按照劑量遞增方式（0.1、0.5、1.0 mg/kg，i.p.），小鼠腹腔連續(xù)7 d 注射安非他命，停藥7 d，0.1 mg/kg 與0.5 mg/kg 可誘導敏化行為，且與 NAc 中 ERK-ΔFosB信號通路上調(diào)密切相關(guān)[10]。這些發(fā)現(xiàn)進一步支持了本研究的結(jié)果。最近研究發(fā)現(xiàn)，小鼠NAc 中DUSP15 在嗎啡CPP 形成及復燃中表達降低，過表達DUSP15 通過降低p-ERK 的表達阻止CPP 的形成及復燃，且促進了 CPP 消退[6]。本研究表明，NAc DUSP15 通過下調(diào)p-ERK 阻止嗎啡誘導的敏化行為，得出的結(jié)論進一步拓展了DUSP15在嗎啡獎賞中的作用機制。

大量研究表明，NAc中p-ERK 在毒品成癮的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。ERK 有望成為治療毒品成癮的關(guān)鍵靶向分子[11]。因此，阻斷ERK 活化可能是治療毒品成癮的一種新策略。本研究進一步完善了ERK 在毒品成癮中的激活和失活機制。這不僅為阿片成癮的預防和治療提供新的思路，也為開發(fā)新的特異性藥物提供新的藥物作用靶點。