匙指蝦科線粒體基因組結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)進(jìn)化分析

朱隴強(qiáng)，朱志煌，朱雷宇，王定全，王健鑫*，林琪*

(1.福建省水產(chǎn)研究所 福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361013；2.浙江海洋大學(xué) 海洋微生物分子生態(tài)與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室,浙江 舟山 316022)

匙指蝦科Atyidae屬于甲殼動(dòng)物亞門(mén)Crustacea軟甲綱Malacostraca十足目Decapoda真蝦下目Caridea，該科物種廣泛分布于熱帶和溫帶的淡水和海水環(huán)境中[1]。全球匙指蝦科物種約400種，分布于約40個(gè)屬中[2]，最典型特征是螯上具有毛發(fā)狀的剛毛，體型通常較小(全長(zhǎng)<35 mm)[3]。匙指蝦科物種在沉積物分解、顆粒有機(jī)物處理及生境底棲生物群落組成過(guò)程中發(fā)揮著重要的生態(tài)作用[4]。近年來(lái)，基于部分線粒體基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析指出,匙指蝦科物種分類(lèi)關(guān)系受地殼運(yùn)動(dòng)影響，古老的岡瓦大陸斷裂與特提斯海封閉可能是引起該類(lèi)群物種進(jìn)一步分化的主要原因。因此，盡可能全面地收集匙指蝦科物種線粒體基因組數(shù)據(jù)，對(duì)開(kāi)展分子系統(tǒng)學(xué)的相關(guān)研究非常有必要。

線粒體普遍存在于真核細(xì)胞中，負(fù)責(zé)大多數(shù)細(xì)胞ATP的產(chǎn)生，呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通常由參與電子傳遞的37個(gè)編碼基因(13個(gè)PCGs、22個(gè)tRNA和2個(gè)rRNAs)組成[1]。線粒體基因通常被用作遺傳標(biāo)記，以確定生物進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[5-6]。本研究中，基于GenBank中已公布的24種匙指蝦科物種線粒體基因組的全序列，并結(jié)合地理學(xué)知識(shí)對(duì)其進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)相關(guān)分析，以期為深入研究匙指蝦科物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取

從GenBank線粒體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中檢索到本研究中24種匙指蝦科物種線粒體全基因組序列，并檢索各物種樣本的來(lái)源(圖1)。未檢索到中文名稱(chēng)的物種直接用拉丁名表示，物種相關(guān)信息見(jiàn)表1。

圖1 GenBank中已公布的匙指蝦科線粒體基因組樣本類(lèi)群的分布Fig.1 Distribution of the mitogenome sample taxa of Atyidae published in GenBank

1.2 方法

1.2.1 基因變異位點(diǎn)分析 使用ClustalW 2軟件對(duì)24種匙指蝦科物種線粒體基因組的13個(gè)PCGs序列和2個(gè)rRNA序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，然后選擇DnaSP 6[7]軟件中的多態(tài)位點(diǎn)分析剔除缺失位點(diǎn),并整理各基因的變異位點(diǎn)值。

1.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 使用ClustalW 2軟件對(duì)24種匙指蝦科物種線粒體基因組中13個(gè)PCGs序列進(jìn)行串聯(lián)比對(duì)，外類(lèi)群為中華小長(zhǎng)臂蝦Palaemonsinensis線粒體基因組中13個(gè)PCGs序列。將比對(duì)后的序列通過(guò)Gblocks軟件[8]提取保守序列?；趈ModelTest軟件[9]對(duì)保守序列的替代模型進(jìn)行分析，根據(jù)赤池信息準(zhǔn)則(akaike criteria,AIC)，GTR+I+G (-lnL=150 789.030 2)為最佳替代模型用于后續(xù)計(jì)算分析。采用最大似然法(Maximum likelihood，ML)、鄰接法(Neighbor joining，NJ)和貝葉斯法(Bayesian inference，BI)分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。其中，采用PhyML 3.1軟件構(gòu)建ML樹(shù)，通過(guò)自展法(Bootstrap=1 000)評(píng)估節(jié)點(diǎn)可靠性;采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建NJ樹(shù)，自展值設(shè)置為1 000;采用MrBayes 3.2.6軟件[10]構(gòu)建BI樹(shù)，運(yùn)行世代數(shù)為1×107，運(yùn)行一次由4條鏈組成，包括3條熱鏈(heated chain)和1條冷鏈(cold chain)，每運(yùn)行500個(gè)世代取樣一次，每500個(gè)運(yùn)行世代顯示一次進(jìn)展信息，收斂診斷設(shè)置為5 000。

1.2.3 物種分化時(shí)間估算 采用BEAST 2.6.3軟件[11]估算匙指蝦科各物種的分化時(shí)間。基于赤池信息準(zhǔn)則，GTR+I+G為最佳分析模型。設(shè)置樹(shù)先驗(yàn)(tree prior)選擇適用于分析來(lái)自不同物種序列的Yule模型。依據(jù)寬松對(duì)數(shù)正態(tài)分子鐘(uncorrelated relaxed lognormal clock)配合默認(rèn)參數(shù)配置的xml文件，將運(yùn)行世代數(shù)設(shè)置為10 000,運(yùn)行結(jié)束后所獲log文件中的ucld.stdev值為0.425，該值未接近0，故分子鐘選擇寬松分子鐘模型。依據(jù)生命進(jìn)化時(shí)間信息公共知識(shí)庫(kù)(http://www.timetree.org/)記錄的匙指蝦科起源時(shí)間和Jurado-Rivera等[12]對(duì)匙指蝦類(lèi)群中部分適應(yīng)洞穴生活的蝦種分歧時(shí)間作為校準(zhǔn)節(jié)點(diǎn)，計(jì)算匙指蝦科的物種分歧時(shí)間。進(jìn)行馬爾可夫分析的運(yùn)行鏈長(zhǎng)為5×107，每運(yùn)行1 000次抽樣一次，最后棄掉25%的老化鏈。采用FigTree 1.4.4軟件對(duì)估算結(jié)果進(jìn)行注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 匙指蝦科線粒體基因組的特征分析

從表1可見(jiàn)，匙指蝦科24個(gè)物種線粒體基因組的長(zhǎng)度為15 318～16 430 bp，AT含量為62.20%～70.19%，高AT含量在十足動(dòng)物中普遍存在。另外，24個(gè)匙指蝦科物種線粒體基因的排列順序完全相同，說(shuō)明匙指蝦科物種在進(jìn)化中較保守。

表1 GenBank中已公布的匙指蝦科物種線粒體基因組序列信息Tab.1 Mitogenome sequence information of species in Atyidae published in GenBank

2.2 匙指蝦科線粒體基因組的差異位點(diǎn)分析

從表2可見(jiàn)：匙指蝦科線粒體基因組的15個(gè)基因(13個(gè)PCGs和2個(gè)rRNAs)中，nd6、atp8、nd2、nd4L、nd5、nd4和nd3 7個(gè)基因變異位點(diǎn)比例超過(guò)60%，cox1和cox3基因變異位點(diǎn)比例較低，分別為46.22%和48.85%；nd5基因變異位點(diǎn)數(shù)最多(1 098個(gè))，其次為nd4和cox1基因，cox1基因變異位點(diǎn)比例較低，不適用于群體遺傳分析，而nd5和nd4基因變異位點(diǎn)比例較高，基因長(zhǎng)度較長(zhǎng)，且變異位點(diǎn)數(shù)也多，故可作為匙指蝦科理想的分子標(biāo)記，用于分析不同群體間的生物多樣性。

表2 匙指蝦科線粒體基因組的基因變異位點(diǎn)Tab.2 Gene variation sites in the mitogenome of Atyidae

2.3 匙指蝦科線粒體基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于24種匙指蝦科物種線粒體基因組的13個(gè)PCGs序列，利用ML、NJ和BI方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，僅在個(gè)別物種間的分支關(guān)系存在差異。從圖2可見(jiàn)：Atyinae亞科聚為一大支,其內(nèi)部分支包括米蝦屬Caridina和新米蝦屬Neocaridina，新米蝦屬Neocaridina在米蝦屬Caridina內(nèi)聚為一支；Typhlatyinae、Caridellinae和Paratyinae亞科(TCP)聚為一大支，其中，Paratyinae單獨(dú)為一支，Caridellinae的兩個(gè)物種不在同一分支上；而Typhlatyinae聚為一支(除Typhlatyagalapagensis外)，其內(nèi)部分支包括Typhlatya、Stygiocaris和Typhlopatsa3個(gè)屬，其中Stygiocaris和Typhlopatsa聚為一支，互為姊妹關(guān)系?；贛L方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，Halocaridinidesrubra與Typhlatyagalapagensis聚為一支，自展值較低(43)，Halocaridinidesfowleri獨(dú)自為一支，三者的關(guān)系為(…+(Halocaridinidesfowleri+(Halocaridinarubra+Typhlatyagalapagensis)+…))；基于NJ和BI方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)一致，結(jié)果顯示，這3個(gè)物種各自為一支且得到較高的自展值(>86)和后驗(yàn)概率(>0.88)，它們之間的關(guān)系為(…+(Halocaridinidesfowleri+(Typhlatyagalapagensis+(Halocaridinarubra+…))))。

利用ML構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分支上的數(shù)值為自展值；利用NJ和BI構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分支上的數(shù)值為自展值和后驗(yàn)概率。Value on the branch of the phylogenetic tree constructed by ML is the bootstrap probability;the value on the branch of the phylogenetic tree constructed by NJ and BI is the bootstrap probability and posterior probability.圖2 采用ML、NJ和BI方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree constructed using ML,NJ and BI methods

2.4 匙指蝦科線粒體基因組的分歧時(shí)間分析

基于最適合的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和分子進(jìn)化速率，用寬松分子鐘模型估算TCP物種最近的共同祖先在266.76～329.99 Mya(圖3，節(jié)點(diǎn)B)，其中，Caridellinae亞科物種最先出現(xiàn)分化是在205.63～285.12 Mya(圖3，節(jié)點(diǎn)C)；Typhlatyinae亞科物種最先出現(xiàn)分化是在174.94～242.37 Mya(圖3，節(jié)點(diǎn)E)，Typhlopatsa和Stygiocaris亞科物種最近的共同祖先在76.07～108.53 Mya(圖3，節(jié)點(diǎn)O)；Atyinae亞科物種最近的祖先在178.45～280.34 Mya(圖3，節(jié)點(diǎn)D)，其中新米蝦屬Neocaridina物種最近的共同祖先在14.70～41.69 Mya(圖3，節(jié)點(diǎn)W)。

3 討論

3.1 匙指蝦科物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

匙指蝦科所含物種相對(duì)較少，但其內(nèi)部分類(lèi)關(guān)系一直存在爭(zhēng)議。本研究中，利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)有的線粒體基因組序列對(duì)24種匙指蝦科物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，研究結(jié)果與前人的結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，部分物種在分類(lèi)地位上存在差異。本研究中，Typhlatyagarciai、Typhlatyapearsei、Typhlatyamitchelli、Typhlatyadzilamensis、Typhlatyaconsobrina和Typhlatyataina聚為一支，其內(nèi)部Typhlatyaconsobrina和Typhlatyataina互為姊妹關(guān)系且聚為一小支，其余4個(gè)物種聚為另一支，且各節(jié)點(diǎn)的ML值和BI值均較高，這與Jurado-Rivera等[12]基于13個(gè)PCGs序列的研究結(jié)果一致。然而Park等[13]基于13個(gè)PCGs序列的研究結(jié)果顯示，Typhlatyagarciai和Typhlatyapearsei與該分支其他物種的親緣關(guān)系均發(fā)生了變化(圖4A)，值得注意的是，該研究部分的分支節(jié)點(diǎn)支持度較低；Botello等[19]基于rrnL、COI、cytb、LSU、SSU和組蛋白H3A序列的研究結(jié)果顯示，Typhlatyagarciai獨(dú)自形成一支且與其余5個(gè)種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4B)，各節(jié)點(diǎn)支持度較高，然而部分基因序列往往因可提取的信息有限而不能解決一些較煩瑣的系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題，但該分支各物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近或許能支持本研究系統(tǒng)發(fā)育分析的準(zhǔn)確性。另外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，基于不同的進(jìn)化分析方法，Halocaridinarubra和Typhlatyagalapagensis的親緣關(guān)系存在差異，前人的研究結(jié)果顯示，Halocaridinarubra和Typhlatyagalapagensis為姊妹關(guān)系且獨(dú)自形成一個(gè)分支[12，19]，這個(gè)結(jié)果與本研究中基于ML分析方法的研究結(jié)果一致，但本研究中節(jié)點(diǎn)支持度相對(duì)較低，說(shuō)明二者的關(guān)系有待進(jìn)一步研究確定。

圖4 前人有關(guān)部分匙指蝦科物種的種類(lèi)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系假設(shè)[12,19]Fig.4 Previous hypotheses about the phylogenetic relationship of some species in Atyidae[12,19]

數(shù)字代表節(jié)點(diǎn)95% CI，板塊運(yùn)動(dòng)示意圖參考Jurado-Rivera等[12]的研究。Numbers represent 95% credible intervals (CI),and the sketch map of plate movement is referred to the study of Jurado-Rivera et al[12].圖3 匙指蝦科物種分歧時(shí)間估算Fig.3 Estimation of the divergence time of the species in Atyidae

3.2 匙指蝦科物種分歧演化

基于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可知，匙指蝦科物種被分為兩大支系，TCP為一個(gè)支系，Atyinae類(lèi)群為另一支系。在TCP支系中，來(lái)自澳大利亞的物種Paratyaaustraliensis在石炭紀(jì)中期到二疊紀(jì)晚期時(shí)段就以分化形成(圖3，節(jié)點(diǎn)B)，比岡瓦大陸斷裂的時(shí)間至少早100 Mya，說(shuō)明該物種的形成與岡瓦大陸的斷裂毫無(wú)聯(lián)系，由此推測(cè)，該物種可能起源于南太平洋或隨著洋流擴(kuò)散到澳大利亞[20]。古老的岡瓦大陸斷裂與特提斯海封閉導(dǎo)致一些同類(lèi)群生物隔離和高度分散分布。來(lái)自Typhlatyinae亞科的洞穴蝦分布于東太平洋、加勒比海、大西洋、地中海、馬達(dá)加斯加和澳大利亞附近島嶼(圖1)，這類(lèi)物種從未在開(kāi)闊的海洋棲息地被報(bào)道，大多數(shù)物種棲息在島嶼或狹窄的海岸[12]。這種棲息環(huán)境導(dǎo)致這些物種具有較強(qiáng)的地域性，地理板塊運(yùn)動(dòng)可能是導(dǎo)致這些物種分散的最好媒介。在Typhlatyinae亞科中，Typhlatyagalapagensis棲息于加拉帕戈斯群島且在侏羅紀(jì)早期就以分化形成(圖3，節(jié)點(diǎn)E)，加拉帕戈斯群島獨(dú)特的地理位置及Typhlatyagalapagensis適應(yīng)洞穴棲息的特點(diǎn)，可能會(huì)導(dǎo)致該物種的入侵能力極為有限。由此推測(cè)，加拉帕戈斯群島可能在侏羅紀(jì)時(shí)期就已存在，但這種推測(cè)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證?；贚eprieur等[21]的研究可知，從白堊紀(jì)時(shí)代開(kāi)始，岡瓦大陸開(kāi)始出現(xiàn)斷裂，特提斯海域面積縮小，而岡瓦大陸的斷裂可能是導(dǎo)致Typhlatyinae中棲息于岡瓦大陸沿岸的洞穴蝦出現(xiàn)分化的主要原因(圖3，節(jié)點(diǎn)H)。來(lái)自岡瓦大陸沿岸的洞穴蝦物種被分為兩個(gè)支系，其中，第一支系所含物種主要位于大西洋西部及位于非洲東部一個(gè)未描述的種(圖3，節(jié)點(diǎn)I),該類(lèi)群中的Typhlatyailiffei、Typhlatyasp.JR2016聚為一支(圖3，節(jié)點(diǎn)L)，分化時(shí)間發(fā)生在87.47～125.08 Mya，這與Jurado-Rivera等[12]估算的分歧時(shí)間91～121 Mya基本相吻合；該類(lèi)群的其余物種地理分布相對(duì)較集中且聚為一支(圖1，圖3，節(jié)點(diǎn)M)。另一支系所含物種主要位于地中海西部、澳大利亞西部、馬達(dá)加斯加和加勒比海(圖1)，該類(lèi)群中位于加勒比海的Typhlatyamonae和位于地中海的Typhlatyaarfeae、Typhlatyamiravetensis聚為一支(圖3，節(jié)點(diǎn)K)，分歧時(shí)間發(fā)生在91.12～124.14 Mya，這與南美洲和非洲被大西洋分隔的時(shí)間基本相吻合[21]；該類(lèi)群中位于馬達(dá)加斯加的Typhlopatsapauliani與位于澳大利亞西部的Stygiocaris物種聚為一支，分歧時(shí)間發(fā)生在76.06～108.53 Mya，但印度板塊與南極洲分裂的時(shí)間約為120 Mya[21]，所以岡瓦大陸的斷裂時(shí)間不能解釋該分支的分歧時(shí)間，但有研究推測(cè)，Stygiocaris物種的祖先生活在古特提斯海沿海棲息地，隨后被板塊的運(yùn)動(dòng)分隔開(kāi)[22]。所以，任何一個(gè)物種的進(jìn)化不可能符合一種單一的構(gòu)想，它需要更加復(fù)雜的混合模型來(lái)反映。

來(lái)自Atyinae亞科的物種主要分布在太平洋南部和西北部(圖1)。該分支中所含物種均為淡水蝦，其中，米蝦屬Caridina幼蟲(chóng)的發(fā)育需要高鹽度水體，其幼蟲(chóng)孵化后進(jìn)入浮游期，被動(dòng)漂流在海洋中，蛻變后又遷徙到淡水棲息地[23]。本研究中現(xiàn)有的4種米蝦屬Caridina物種中，Caridinamultidentata在二疊紀(jì)早期到侏羅紀(jì)早期時(shí)段分化形成(圖3，節(jié)點(diǎn)D)，為獨(dú)立一個(gè)分支，該物種以其獨(dú)有的形態(tài)適應(yīng)在湍急的水流中攀附棲息[23]，說(shuō)明該物種隨洋流擴(kuò)散的能力較強(qiáng)，其余C.indistincta、C.gracilipes和C.cf.niloticaHMG-216 3種米蝦在三疊紀(jì)早期到白堊紀(jì)早期時(shí)段分化形成，同期分化形成的還有新米蝦屬Neocaridina(圖3，節(jié)點(diǎn)G)，Caridina3種米蝦均適應(yīng)于水流流速較低的植被下棲息[23-24]，說(shuō)明它們隨洋流擴(kuò)散的能力較弱。

4 結(jié)論

1)匙指蝦科物種線粒體基因的排列順序相同，nd5和nd4基因可作為匙指蝦科理想的分子標(biāo)記，用于分析不同群體間的生物多樣性。

2)基于NJ和BI方法構(gòu)建的24種匙指蝦科物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系完全一致,基于ML方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中個(gè)別物種間的分支關(guān)系存在差異，其中，Atyinae亞科為單系群，Typhlatyinae和Caridellinae亞科均為非單系群。

3)根據(jù)分子鐘估算結(jié)果推測(cè)，Atyinae物種最近的共同祖先可能出現(xiàn)在178.45～280.34 Mya，即二疊紀(jì)早期到侏羅紀(jì)時(shí)段，Paratyinae、Typhlatyinae和Caridellinae亞科物種最近的共同祖先可能出現(xiàn)在266.76～329.99 Mya，即石炭紀(jì)中期到二疊紀(jì)時(shí)段。