刺參Wnt9基因克隆、組織分布及在胚胎發(fā)育中的表達(dá)分析

馬得友，于蓮蓮，林威港，汪成粱，丁君，常亞青

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

胚胎期體軸的正確建立是多細(xì)胞動物器官發(fā)生與個(gè)體形態(tài)形成的關(guān)鍵基礎(chǔ)[1-4]。Wnt(wingless-type MMTV integration site family)是一類重要的分泌型糖蛋白信號分子[5-7]，其與膜上相應(yīng)受體結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)的多種信號通路，在動物胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和器官發(fā)育等多種生命過程中發(fā)揮重要作用[8]，如調(diào)控胚胎體軸極性、胚胎期細(xì)胞的增殖分化與遷移及組織器官發(fā)育等[9-11]。Wnt基因與多樣性胚軸在生物系統(tǒng)演化過程中同時(shí)出現(xiàn)，表明Wnt是最早在體軸形成與發(fā)育過程中扮演重要角色的基因家族之一[12]。

關(guān)于Wnt信號配體蛋白在后口動物胚胎發(fā)育與體軸建立的研究，較多的是圍繞Wnt3、Wnt8、Wnt11等少數(shù)基因展開[13-15]。Wnt8是調(diào)控紫海膽Strongylocentrotuspurpuratus原腸胚內(nèi)中胚層細(xì)胞增殖與分化的重要基因[15]。Wnt3和Wnt11則在佛羅里達(dá)文昌魚Branchiostomafloridae中原腸晚期體軸后端的三胚層中表達(dá)，與此時(shí)背腹軸的形成有關(guān)[13]。而Wnt9作為Wnt家族基因成員之一，在兩側(cè)對稱動物祖先中出現(xiàn)，并在紫海膽、爪蟾Xenopustropicalis、斑馬魚Daniororio等后口動物模式物種中保留下來，暗示著Wnt9基因可能對動物對稱性發(fā)育的進(jìn)化具有重要意義[12]。研究人員關(guān)注到Wnt9在海參Holothuriaglaberrima腸道再生過程中顯著上調(diào)表達(dá)[16-17]，在凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei中呈組成型表達(dá)[18]，體現(xiàn)出該基因在功能上的多樣性。然而有關(guān)Wnt9參與水生無脊椎動物胚胎發(fā)育過程的研究卻鮮有報(bào)道。

刺參Apostichopusjaponicus既是中國主要海水養(yǎng)殖種類，也是探究后口動物進(jìn)化與起源的理想材料[19-20]。作為棘皮動物的代表種類[21]，刺參幼體變態(tài)時(shí)，由兩側(cè)對稱的大耳幼體轉(zhuǎn)變?yōu)槲遢椛鋵ΨQ的稚參，形成典型的頭尾軸。研究人員已清晰地描述了刺參胚胎發(fā)育過程及變態(tài)期幼體形態(tài)的巨大變化，然而有關(guān)Wnt基因參與海參類早期發(fā)育過程的研究嚴(yán)重不足，目前僅有Wnt9基因參與海參腸道再生過程的文獻(xiàn)報(bào)道[17]。本研究中，通過RACE技術(shù)克隆刺參Wnt9基因的cDNA全長，定量分析其在刺參主要組織和早期發(fā)育階段的表達(dá)情況，利用整體原位雜交技術(shù)進(jìn)一步檢測該基因在幼蟲變態(tài)過程中的分布特征，從而在轉(zhuǎn)錄水平初步查明Wnt9基因在刺參變態(tài)發(fā)育過程中的作用，以期為深入闡釋棘皮動物變態(tài)期的形態(tài)重塑及對稱性轉(zhuǎn)變機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刺參幼體取自大連市鑫玉龍海洋生物種業(yè)科技股份有限公司育苗室，2齡成體刺參(體質(zhì)量約100 g)采自大連市螞蟻島海域。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 幼體刺參：根據(jù)刺參幼體早期發(fā)育標(biāo)準(zhǔn)，收集受精卵、8細(xì)胞、16細(xì)胞、64細(xì)胞、256細(xì)胞、囊胚、原腸胚、小耳幼體、大耳幼體、樽形幼體和稚參共11個(gè)階段的活體樣品，保存在液氮中運(yùn)至農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，然后提取其總RNA，隨即反轉(zhuǎn)成cDNA存放于-20 ℃冰箱，用于刺參Wnt9基因在胚胎和變態(tài)發(fā)育過程中的表達(dá)分析。

成體刺參：在冰上解剖活體取其體壁、腸、呼吸樹、肌肉、性腺、管足和體腔細(xì)胞，經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存。在液氮中研磨后，提取各組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于Wnt9基因cDNA全長的RACE克隆和組織表達(dá)。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 使用TransZol Up Plus RNA Kit(北京全式金有限公司)提取刺參腸、呼吸樹、體壁等主要組織及早期發(fā)育各階段樣品的總RNA，通過SimpliNano微量核酸分析儀檢測RNA的濃度、純度，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。將質(zhì)量合格的RNA保存于-80 ℃超低溫冰箱,用于后續(xù)cDNA的合成。

以腸總RNA為模板，使用PrimerScriptTMRT Reagent反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA第一鏈，用于擴(kuò)增Wnt9基因中間保守區(qū)域。反應(yīng)體系(20 μL)：Oligo dT Primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，5×Primer ScriptTMBuffer 4 μL，Primer ScriptTMRT Enzyme MixⅠ 1 μL，total RNA 2 μL，RNase-free ddH2O 11 μL。通過SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)合成5′RACE及3′RACE cDNA第一鏈，用于后續(xù)Wnt9 cDNA全長的克隆。

1.2.3Wnt9基因全長cDNA的RACE克隆 基于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室刺參幼體轉(zhuǎn)錄組中注釋為Wnt9的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物(表1)。以腸cDNA為模板進(jìn)行保守片段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(10 μL):cDNA 0.5 μL，Buffer 1 μL，Taq 0.2 μL,dNTP 0.8 μL，Wnt9-F1、R1各0.4 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃下預(yù)變性3 min；94 ℃下變性30 s，59 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸5 min。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用TIANgel Midi Purification Kit(Tiangen)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化。將回收的產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)入Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金有限公司)中，搖床振蕩1 h后將其均勻涂布于含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基平板上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置過夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落于盛有液體LB培養(yǎng)基的離心管中，搖床振蕩，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，篩選有插入片段的陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

表1 試驗(yàn)用引物Tab.1 Primer sequences used in this study

通過得到的Wnt9中間片段設(shè)計(jì)RACE反應(yīng)特異引物(表1)，根據(jù)SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit操作說明書進(jìn)行5′RACE和3′RACE擴(kuò)增。5′RACE的第一次梯度PCR反應(yīng)體系(10 μL):Long Taq 0.2 μL，Buffer 1 μL，dNTP 0.8 μL，Long引物0.4 μL，Wnt9-5′-R1 0.4 μL，模板0.5 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性3 min；94 ℃下變性30 s，67 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸5 min。以5倍稀釋后的第一次PCR產(chǎn)物為模板，以Wnt9-5′-R2、Short為引物，進(jìn)行第二次5′RACE的PCR擴(kuò)增。3′RACE的PCR體系及反應(yīng)條件與5′RACE相似。RACE產(chǎn)物測序操作與保守片段克隆試驗(yàn)中的測序步驟相同。

1.2.4 序列結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用NCBI中的ORF-Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進(jìn)行Wnt9基因的開放閱讀框分析；使用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)；使用Expasy Protparam工具和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測Wnt9蛋白的基本理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域；采用SignalP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/)預(yù)測信號肽及糖基化位點(diǎn)；通過SOPMA在線軟件和SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)分析Wnt9蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；利用ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalW2/)進(jìn)行氨基酸序列多重比對；利用MEGA 7.0構(gòu)建基于鄰近法(Neighbor-joining)的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)克隆出的Wnt9基因cDNA全長序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(表1)。按照TransStart Top Green qPCR Super Mix Kit(北京全式金有限公司)的操作說明書，以Cytb為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler?96，Roche)進(jìn)行Wnt9 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：Super Mix 10 μL，cDNA 2 μL，qWnt9-F、R各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序：94 ℃下預(yù)變性30 s；94 ℃下變性5 s，60 ℃下退火30 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)平行并重復(fù)3次技術(shù)測定。反應(yīng)結(jié)束后，首先進(jìn)行溶解曲線分析，確認(rèn)引物的特異性，采用2-△△Ct法計(jì)算基因的表達(dá)量，分別以管足和受精卵時(shí)期的基因表達(dá)量為基值，計(jì)算其他組織和發(fā)育時(shí)期的基因相對表達(dá)量。

1.2.6 RNA探針合成 在Wnt9基因cDNA全長序列中設(shè)計(jì)引物(表1)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后將特異目的片段進(jìn)行切膠回收并純化，置于-20 ℃中保存?zhèn)溆?。參照文獻(xiàn)[22]中的方法，使用DIG RNA Labeling Mix Kit(Roche)制備RNA探針。具體操作如下：1)在無酶微量離心管中配制20 μL PCR反應(yīng)體系，包含DNA純化產(chǎn)物 10 μL、DIG RNA Labeling Mix 2 μL、Transcription Buffer 2 μL、T7酶2 μL和ddH2O 4 μL，離心混勻后于37 ℃下反應(yīng)2 h；2)反應(yīng)完成后加入2 μL DNA酶，37 ℃下反應(yīng)15 min，以消化剩余模板，隨后加入2 μL 0.2 mol/L EDTA(pH 8.0)終止消化；3)加入-20 ℃預(yù)冷的4 mol/L LiCl 2.5 μL、無水乙醇75 μL，-20 ℃沉淀過夜；4) 次日，4 ℃下以13 000g離心15 min，再用-20 ℃預(yù)冷的無水乙醇(體積分?jǐn)?shù)為70%)洗滌2次，隨后以13 000g離心5 min，去掉上清液，于超凈工作臺干燥，最后加入25 μL ddH2O溶解RNA，并用微量分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA探針的濃度及質(zhì)量，最后將探針分裝，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 整體原位雜交 參考斑馬魚胚胎整體原位雜交技術(shù)[23]，并針對刺參幼體特點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化。具體操作如下(本節(jié)中%均指體積分?jǐn)?shù))：

1)樣品處理。以變態(tài)前的晚期大耳幼體、變態(tài)中的樽形幼體及變態(tài)后的稚參為材料，取3個(gè)階段已被逐步麻醉的幼蟲，加入4%的多聚甲醛(PFA)，并于-20 ℃冰箱中固定及保存；使用前，置于無水甲醇中脫水至少2 h。

2)復(fù)水。復(fù)水步驟：60%甲醇+40%PBST，5 min；30%甲醇+70%PBST，5 min；100%PBST，5 min，2次。

3)蛋白酶K處理。用質(zhì)量濃度5 μg/mL的蛋白酶K在室溫下分別處理大耳幼體1 min、樽形幼體15 min、稚參20 min；反應(yīng)結(jié)束后，用PBST漂洗2次，每次5 min。

4)再固定。用4% PFA室溫固定樣品20 min，去除固定液后放在搖床上，用PBST慢速漂洗2次，每次5 min。

5)預(yù)雜交。在無探針的預(yù)雜交液Hybe(-)(500 mL甲酰胺，250 mL 20×SSC，9.2 mL 1 mol/L檸檬酸，1 mL Tween-20，用雙蒸水定容至1 L)中，對幼體進(jìn)行45 ℃水浴搖振(75～80 r/min) 1 h。

6)雜交。將正義探針(引物Wnt9-control)及反義探針(引物Wnt9-probe)分別加至雜交緩沖液Hybe+(向Hybe(-)溶液中加入tRNA和肝素配制而成)中，使探針終質(zhì)量濃度為1 ng/μL；將200 μL雜交液加入樣品管中，在雜交儀中45 ℃水浴搖振(75～80 r/min)過夜。

7)洗脫。依次按照100% Hybe(-)10 min→75%Hybe(-)+25% 2×SSC 10 min→50%Hybe(-)+50% 2×SSC 10 min→25%Hybe(-)+75% 2×SSC 10 min→100% 2×SSC 10 min→100% 0.2×SSC 4×15 min進(jìn)行梯度洗脫，移除多余的探針。

8)抗體孵育。用PBST-SB溶液(1×PBST、2%山羊血清、2 mg/mL BSA按照體積比為1∶1∶1配制)將幼體封閉2 h，移去封閉液后，抗體(用PBST-SB按1∶5 000稀釋的地高辛抗體)于4 ℃下過夜孵育。

9)顯色及鏡檢。移去抗體后，室溫下用PBST快速洗5次，每次5 min，再用BCL Buffer(1 mol/L pH為9.5的Tris-HCl 20 mL，5 mol/L NaCl 4 mL，0.5 mol/L MgCl210 mL，20% Tween-20 1 mL，用雙蒸水定容至50 mL) 洗滌3次，每次5 min。隨即加入BCL Buffer與BM Purple(Roche)按照1∶1配成的顯色液，避光顯色4 h；顯色完成后，用4%多聚甲醛固定幼蟲至少20 min，再用1×PBST洗滌3次，每次5 min；最后吸干PBST，與70%甘油混合后，置于載玻片上，用顯微鏡下(Leica)對正義探針處理組(陰性對照)、反義探針處理組(陽性信號組)觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示基因mRNA相對表達(dá)量，通過SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，使用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Wnt9基因克隆及全長cDNA序列分析

從圖1可見，克隆得到刺參Wnt9 cDNA序列全長為1 603 bp，包括97 bp的5′UTR、1 104 bp的ORF和404 bp的3′UTR，可編碼367個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白相對分子質(zhì)量為41 400。預(yù)測刺參Wnt9氨基酸序列包含1個(gè)跨膜區(qū)(7～26 aa)、1個(gè)Wnt1保守結(jié)構(gòu)域(59～366 aa)，以及2個(gè)位于N-101和N-316處的糖基化位點(diǎn)。在預(yù)測出的Wnt9蛋白二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占35.15%，β-轉(zhuǎn)角占3.27%，無規(guī)則卷曲占49.32%，延伸鏈占12.26%。

黑體表示起始密碼子(ATG)及終止密碼子(TAA)；下劃線表示跨膜區(qū)；陰影區(qū)表示W(wǎng)nt1結(jié)構(gòu)域；陰影區(qū)下劃線表示N-糖基化位點(diǎn)。Black stands for the start(ATG) and stop codon(TAA);transmembrane domain is underlined;the Wnt1 domain are shaded in light gray;the N-glycosylation sites are underlined in shadow area.圖1 刺參Wnt9基因的全長cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Wnt9 gene in sea cucumber Apostichopus japonicus

2.2 多重序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

用于多重序列比對的11個(gè)物種及其Wnt9氨基酸序列在NCBI中的登錄號見表2。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，刺參與海參(GenBank:GQ243223.1)Wnt9氨基酸序列的一致性最高(66.12%)，與紫海膽Wnt9a氨基酸序列一致性較高(41.17%)。刺參Wnt9蛋白具有Wnt家族特有的保守片段 CKCHGVS及25個(gè)形成內(nèi)部二硫鍵的半胱氨酸(圖2)。

表2 用于氨基酸序列同源比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析的Wnt9信息Tab.2 Information on Wnt9 for comparative identify of amino acid sequences and phylogenetic analysis

陰影區(qū)域表示同源性氨基酸，黑色表示同源性為100%，粉紅色表示同源性為>75%，淺藍(lán)色表示同源性>50%；紅色虛線方框表示W(wǎng)nt保守片段CKCHGVS，下劃線表示W(wǎng)nt1結(jié)構(gòu)域。Shaded area means homology of amino acids:completely conserved positions are shaded in black,position with >75% similarity is shaded in pink,and position with >50% similarity is shaded in light blue;Wnt conserved amino acid residues CKCHGVS are framed in red dotted box,and the Wnt1 domain is underlined.圖2 刺參與其他物種Wnt9氨基酸的多重序列比對Fig.2 Multiple alignment of amino acid sequence of Wnt9 between sea cucumber Apostichopus japonicus and other species

從圖3可見，在比對的物種中，棘皮動物聚為一大支,刺參與海參聚為一支，紫海膽和長棘海星Acanthasterplanci聚為一支，這說明海參綱物種Wnt9氨基酸序列的親緣關(guān)系最近，符合物種進(jìn)化趨勢和親緣關(guān)系。

圖3 不同物種 Wnt9氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of amino acid sequences of Wnt9 in different species

2.3 Wnt9基因在刺參不同組織中的表達(dá)分析

從圖4可見，Wnt9 mRNA在健康刺參7個(gè)組織中均有表達(dá)；在性腺中表達(dá)量最低(P<0.05)，在體壁中表達(dá)量最高(P<0.05)，肌肉、腸、呼吸樹和體腔細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于性腺 (P<0.05)。

2.4 Wnt9基因在刺參早期發(fā)育過程中的表達(dá)分析

從圖5可見：Wnt9基因在刺參整個(gè)早期發(fā)育過程中均有表達(dá)，但表達(dá)幅度有差異;Wnt9在整個(gè)卵裂期和大耳幼體階段呈現(xiàn)持家基因的表達(dá)特征，整體上表達(dá)量都較低，且無顯著性差異(P>0.05)；從樽形幼體開始，該基因的表達(dá)量顯著高于大耳幼體(P<0.05)，到稚參期達(dá)到最高(P<0.05)，此時(shí)期的表達(dá)量為受精卵時(shí)期的60倍。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同。Note:The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences，et sequentia.圖4 Wnt9 mRNA在刺參成體組織中的表達(dá)比較Fig.4 Expression level of Wnt9 mRNA in various tissues of sea cucumber Apostichopus japonicus

圖5 Wnt9 mRNA在刺參發(fā)育階段的表達(dá)比較Fig.5 Expression levels of Wnt9 mRNA during development stages of sea cucumber Apostichopus japonicus

2.5 刺參Wnt9基因在變態(tài)階段的表達(dá)定位

運(yùn)用整體原位雜交技術(shù)在刺參晚期大耳幼體、樽形幼體和稚參3個(gè)階段檢測Wnt9基因的表達(dá)定位情況。從圖6可見：與陰性對照組相比，在Wnt9反義探針處理試驗(yàn)組中，從耳狀幼體至樽形、稚參，陽性信號逐漸增強(qiáng)；晚期大耳幼體時(shí)期即有陽性信號出現(xiàn)，但無明顯集中；樽形時(shí)期陽性信號增強(qiáng)，集中在五對球狀體；稚參時(shí)期陽性信號強(qiáng)，且主要集中在管足和水體腔周圍。

3 討論

3.1 刺參Wnt9的序列特征與進(jìn)化分析

近年來，對一些非模式動物如海蜇(Wnt5)、長牡蠣(Wnt6)和黃顙魚(Wnt2、Wnt3a、Wnt8a)的研究顯示，Wnt家族成員間的結(jié)構(gòu)保守[24-26]。本研究中，采用RACE技術(shù)克隆得到了刺參Wnt9基因的cDNA全長序列，對其氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，刺參Wnt9具有與其他物種Wnt9相同的結(jié)構(gòu)特征，包括Wnt1保守結(jié)構(gòu)域、Wnt家族特有保守片段及參與二硫鍵形成的半胱氨酸保守序列[24,26-29]。多重序列比對表明，刺參Wnt9氨基酸序列與來自棘皮動物Wnt9a和軟體動物Wnt9a的相似程度較高。進(jìn)化樹分析進(jìn)一步揭示了刺參Wnt9氨基酸與同門近緣物種紫海膽、長棘海星的親緣關(guān)系最近。

A～C—用正義探針處理的胚胎(陰性對照);A′～C′—用反義探針處理的胚胎;B′、C′—左上角小圖為箭頭指示的HS、TF區(qū)域陽性信號的放大;HS—球狀體;TF—管足;WV—水體腔。A-C—embryos treated with sense probes(negative control);A′-C′—embryos treated with anti-sense probes;photos B′ and C′ in upper left are enlarged views of the positive signals in HS and TF areas indicated by arrowheads;HS—hyaline sphere;TF—tube feet;WV—water-vascular canal.圖6 刺參變態(tài)過程中Wnt9基因表達(dá)的整體原位雜交分析Fig.6 Whole mount in situ hybridization analyses of Wnt9 gene expression during metamorphosis of sea cucumber Apostichopus japonicus

3.2 刺參Wnt9基因的組織表達(dá)模式

Wnt9基因在哺乳類[30]、魚類[28]和甲殼類[18]等生物不同組織中均有表達(dá)，這表明其可能在多種生命過程中發(fā)揮作用。人體中Wnt9b的突變與子宮縱膈發(fā)生相關(guān)[31]。凡納濱對蝦Wnt9a在胃、后盲囊、肝胰腺中高表達(dá)，還參與了血細(xì)胞抗病毒和細(xì)菌的固有免疫應(yīng)答[18]。黃顙魚Wnt9b在肌肉中的表達(dá)顯著高于其他組織，還可能介導(dǎo)銅影響卵巢發(fā)育和激素合成的變化[25]。本研究中,克隆出的Wnt9基因與其他物種的同源基因一樣，在刺參體壁、肌肉、腸、呼吸樹、管足、體腔細(xì)胞和性腺等全部組織中均有表達(dá)，這說明Wnt9具有作為持家基因行使功能的特征。Wnt9在刺參體壁中表達(dá)水平顯著高于其他組織，在腸中的表達(dá)也較高，可能是因?yàn)轶w壁組織為刺參保護(hù)性屏障，形成抵御不利環(huán)境的第一道防線[32]，而腸是刺參主要免疫組織，由此推測，Wnt9基因可能對刺參免疫應(yīng)答具有重要調(diào)控作用。此外，肌肉中Wnt9的高表達(dá)，意味著Wnt9是一個(gè)多功能基因，與其他Wnt亞家族基因一樣[33-34]，參與刺參的免疫防御及生長發(fā)育過程。

3.3 Wnt9基因在刺參早期發(fā)育過程的表達(dá)特征和空間定位

Wnt信號通路是在進(jìn)化上高度保守的信號途徑，是所有后生動物極化發(fā)育的基礎(chǔ)[33]，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖和凋亡等生理過程中均發(fā)揮重要作用[8]。在紫海膽早期發(fā)育階段,Wnt8基因是控制原腸胚內(nèi)中胚層分化的關(guān)鍵基因，作為主要因子決定前后體軸的形成[15]。Wnt9在海參中通過控制細(xì)胞增殖與分化作用于腸道的再生[17]。本研究中，檢測到刺參Wnt9基因從受精卵到大耳幼體呈現(xiàn)低水平的持續(xù)表達(dá)，這表明該基因在刺參變態(tài)前的胚胎發(fā)育中起著一定的作用，可能與胚胎左右軸的產(chǎn)生有關(guān)。樽形幼體是刺參變態(tài)的過渡形態(tài)，Wnt9在此階段的表達(dá)量是變態(tài)前大耳幼體中的5倍；當(dāng)幼蟲完成變態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橹蓞r(shí)，骨片和管足開始出現(xiàn)，此時(shí)Wnt9的表達(dá)迅速升高，為樽形幼體中的12倍。整體原位雜交分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Wnt9在大耳幼體中陽性信號微弱，而在樽形幼體、稚參中的陽性信號顯著增強(qiáng)。據(jù)此推斷，Wnt9可能通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化參與了稚參體壁發(fā)育、頭尾軸形成及形態(tài)的轉(zhuǎn)變。

4 結(jié)論

1)刺參Wnt9蛋白具有Wnt家族的典型特征，包含2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和多個(gè)保守半胱氨酸殘基。

2)在健康刺參各個(gè)組織中均能檢測到Wnt9 mRNA的表達(dá)，其中，在體壁、腸等固有免疫組織中的表達(dá)量較高。這表明，Wnt9基因能夠參與到刺參成體的免疫防御中。

3)在刺參整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期均檢測到Wnt9基因的持續(xù)表達(dá)，且Wnt9表達(dá)量在樽形幼體中開始明顯升高，在稚參中達(dá)到峰值。這表明，Wnt9基因?qū)Υ虆⒆儜B(tài)后期的生長發(fā)育具有重要作用。