馬氏珠母貝Kelch-like基因的序列及其SNP位點(diǎn)分析

楊創(chuàng)業(yè)，張丞澍，黃靜，郝瑞娟，師尚麗，黃榮蓮*，周芮，邱金玉，顏翼龍，鄧岳文

(1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；3.廣東省海水養(yǎng)殖生物育種工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；4.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(湛江),廣東 湛江 524006)

Kelch樣基因(Kelch-like)是指包含Kelch重復(fù)元件的一系列基因的集合，是存在于動(dòng)物體中具有重要功能的基因家族。Kelch超家族蛋白除含有Kelch結(jié)構(gòu)域外，通常還包括BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和BACK結(jié)構(gòu)域[1]。目前，在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)有40多種Kelch蛋白被報(bào)道[2]。Kelch家族蛋白可以控制肌動(dòng)蛋白微絲的組裝和解聚，參與細(xì)胞骨架形態(tài)的調(diào)節(jié)及偽足的形成，進(jìn)而參與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程[3]。在無脊椎動(dòng)物中，通過對(duì)馬氏珠母貝Pinctadafucatamartensii[4]、長牡蠣Crassostreagigas[5]、櫛孔扇貝Azumapectenfarreri[6]和雙斑蛸Octopusbimaculatus[7]等基因組分析，均鑒定到了多個(gè)Kelch-like基因，但其具體功能及序列變異信息的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少。本課題組前期分析馬氏珠母貝基因組Kelch-like基因在組織轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其在生物礦化相關(guān)組織珍珠囊和外套膜的表達(dá)量相對(duì)較高，暗示其可能參與馬氏珠母貝生物礦化過程。

馬氏珠母貝又稱合浦珠母貝，是培育海水珍珠的重要貝類，目前已成為中國廣東、海南和廣西部分沿海地區(qū)特色產(chǎn)業(yè)之一，其生物礦化過程一直是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)[4]。當(dāng)貝殼受到損傷時(shí)，軟體動(dòng)物會(huì)啟動(dòng)貝殼的修復(fù)機(jī)制，在這一過程中，與生物礦化相關(guān)基因的表達(dá)量通常會(huì)有明顯的變化[8-9]。本研究中，分析了馬氏珠母貝Kelch樣基因序列及其在缺殼損傷后不同時(shí)期的表達(dá)模式，探究了其在珍珠貝貝殼形成中的作用和功能，以期為研究珍珠貝生物礦化過程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用馬氏珠母貝取自廣東省湛江市徐聞縣大井村海區(qū)。取規(guī)格一致、鱗片旺盛、生長良好的個(gè)體用于試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1Kelch-like基因序列分析 利用馬氏珠母貝基因組序列[4]獲得Kelch-likeCDS(coding sequence)序列，利用CDS序列對(duì)全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未發(fā)表)進(jìn)行分析，獲得Kelch-like基因序列全長。采用ORF Finder在線預(yù)測基因開放式閱讀框(open reading frame,ORF)和氨基酸序列，并與基因組氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證；采用DNAMAN軟件和Primer Premier 5.0軟件對(duì)預(yù)測的氨基酸序列進(jìn)行驗(yàn)證，采用NCBI在線比對(duì)，鑒定基因所屬的蛋白家族；采用ProtParam軟在線分析氨基酸序列的理化性質(zhì)，采用SMART軟件預(yù)測目的蛋白的結(jié)構(gòu)域，采用TMHMM Server 2.0軟件在線預(yù)測蛋白序列的跨膜結(jié)構(gòu)域，采用ClustalW2對(duì)氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)；采用SOPMA預(yù)測蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，采用Phyre2在線預(yù)測蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并利用Chimera 1.8.1對(duì)蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)及位點(diǎn)進(jìn)行分析。

1.2.2 組織樣品的采集 隨機(jī)選取10只馬氏珠母貝，在閉殼肌處抽血，經(jīng)離心獲得血細(xì)胞(B)，并剪取馬氏珠母貝的中央膜(MC)、套膜區(qū)(MP)、邊緣膜(ME)、閉殼肌(A)、足(F)、肝胰腺(HE)、性腺(GO)、珍珠囊(PS)和鰓(GI)，經(jīng)液氮速凍后，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 貝殼損傷修復(fù)試驗(yàn) 取35只生長良好的馬氏珠母貝(殼高為5～7 cm)，在其貝殼邊緣的同一位置剪一個(gè)“V”形缺口，在貝殼受損后的0、6、12、24、36、48、120 h分別剪取5只馬氏珠母貝的外套膜，提取總RNA，進(jìn)行熒光定量PCR，以檢測Kelch-like基因在貝殼損傷后的表達(dá)。

1.2.4 總RNA 提取、第一鏈cDNA的合成及基因表達(dá)模式分析 采用Trizol法提取馬氏珠母貝全組織的總RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的完整性，并利用NanoDropND 1000紫外分光光度計(jì)測量A260 mm/A280 mm值，并分析其濃度及純度。采用Reverse Transcriptase M-MLV(RNaseH) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得所需的cDNA模板，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。以GAPDH作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的內(nèi)參基因[10]，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)Kelch-like的熒光定量引物(表1)。采用2-△Ct法對(duì)目的基因的實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算(n=10)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)分析 選取馬氏珠母貝“海選1號(hào)”220個(gè)個(gè)體進(jìn)行靶區(qū)重測序，獲得Kelch-like外顯子區(qū)SNP位點(diǎn)。利用Popgene 32軟件計(jì)算等位基因數(shù)、期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)和哈迪-溫伯格平衡(HWE)等遺傳參數(shù)。采用PIC軟件計(jì)算SNP位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)。多態(tài)性分為3種：高度多態(tài)(PIC≥0.50)、低度多態(tài)(PIC≤0.25)和中度多態(tài)(0.25

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 17統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)基因表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，若差異顯著,采用Tukey法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Kelch-like基因的序列和結(jié)構(gòu)

馬氏珠母貝Kelch-like基因序列全長為2 127 bp，其中，5′UTR為58 bp，3′UTR為44 bp，其開放式閱讀框長度為2 025 bp，可編碼674個(gè)氨基酸(圖1)。通過SMART軟件分析得出，Kelch-like氨基酸序列含有1個(gè)BTB結(jié)構(gòu)域、1個(gè)BACK結(jié)構(gòu)域和2個(gè)Kelch結(jié)構(gòu)域。利用TMHMM Server 2.0軟件預(yù)測其跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，Kelch-like無跨膜螺旋區(qū)，不屬于跨膜蛋白。

2.2 Kelch-like蛋白的理化性質(zhì)

采用ProtParam軟件預(yù)測馬氏珠母貝Kelch-like蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量為76 210，等電點(diǎn)為6.74。其中，含量較高的氨基酸為Leu (11.1%)、Ser (9.5%)、Lys (6.4%)和Val (6.1%)，負(fù)電荷殘基為74個(gè)，正電荷殘基為71個(gè)。預(yù)測該蛋白的脂溶指數(shù)(aliphatic index)為87.92，總平均親水性(grand averageofhydropathy，GRAVY) 為-0.215，屬于親水性蛋白。采用SOPMA軟件對(duì)Kelch-like蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)α螺旋結(jié)構(gòu)占整體的42.14%，β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占整體的5.49%，延伸鏈占整體的18.55%，無規(guī)則折疊占整體的33.82%。

5′和3′非編碼區(qū)用小寫字母表示；編碼區(qū)及推導(dǎo)的氨基酸序列用大寫字母表示；方框內(nèi)為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)；灰色陰影部分為BTB結(jié)構(gòu)域；黃色陰影部分為BACK結(jié)構(gòu)域；綠色陰影部分為Kelch結(jié)構(gòu)域。5′UTR and 3′UTR are shown by letters;open reading fragment and the deduced amino acid sequences are indicated with capital letters;nucleotides in a box are the initiation codon (ATG) and stop codon (TAA);the sequence in grey background represents the BTB domain;the sequence in yellow background represents the BACK domain;the sequence in green background represents the Kelch domain.圖1 馬氏珠母貝Kelch-like核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of Kelch-like in pearl oyster Pinctada fucata martensii

2.3 Kelch-like氨基酸同源性分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用ClustalW2軟件，將馬氏珠母貝、美洲牡蠣Crassostreavirginica(XP_022313917.1)、蝦夷扇貝Mizuhopectenyessoensis(XP_021342105.1)的Kelch-like氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝Kelch-like與其他物種的Kelch-like同源性較高，其中，與美洲牡蠣Kelch-like氨基酸序列的一致性最高(35%)，其次為蝦夷扇貝，一致性為32.05%。另外，分別對(duì)馬氏珠母貝、美洲牡蠣、蝦夷扇貝Kelch-like氨基酸序列的BTB、BACK和Kelch結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝Kelch-like氨基酸序列的BTB和BACK保守性較高，且Kelch具有保守的GG位點(diǎn)(圖2)。

利用Phyre 2程序?qū)︸R氏珠母貝Kelch-like蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，并與美洲牡蠣、蝦夷扇貝的Kelch-like進(jìn)行比較(圖3)，發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝Kelch-like的BTB、BACK和Kelch結(jié)構(gòu)域在高級(jí)結(jié)構(gòu)上高度保守，進(jìn)一步說明其功能的保守性。

2.4 Kelch-like基因的組織表達(dá)模式

從圖4可見，Kelch-like在馬氏珠母貝中央膜、套膜區(qū)、邊緣膜、閉殼肌、足、肝胰腺、性腺、珍珠囊、鰓和血液中均有表達(dá)，其中，在邊緣膜的表達(dá)量顯著高于其他組織 (P<0.05)，其他組織間的表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)。

A、B和C分別表示BTB domain、BACK domain和Kelch domain的多序列比對(duì)；深藍(lán)色陰影為保守的氨基酸；粉色陰影為強(qiáng)相似的氨基酸；淺藍(lán)色為弱相似的氨基酸；右邊數(shù)字為序列氨基酸的個(gè)數(shù)。A,B and C represent the multisequence alignment of BTB domain,BACK domain and Kelch domain respectively;dark blue background indicates the conserved amino acid;pink background indicates amino acid with strong similarity;light blue indicates amino acid with weak similarity;the numbers in the right show the number of the sequence alignment amino acid.圖2 馬氏珠母貝與其他物種Kelch-like氨基酸的多序列比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of amino acid sequence of Kelch-like between the pearl oyster Pinctada fucata martensii and other species

橙色為β折疊，綠色為α螺旋。α helix and β sheet are showed in green and orange color,respectively.圖3 馬氏珠母貝、美洲牡蠣和蝦夷扇貝Kelch-like結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)分子模型Fig.3 Molecular model of the three-dimensional structure of the Kelch-like domain of pearl oyster Pinctada fucata martensii,America oyster Crassostrea virginica and Yesso scallop Mizuhopecten yessoensis

2.5 Kelch-like在貝殼損傷修復(fù)過程中的表達(dá)變化

為探究Kelch-like基因在生物礦化過程中的作用，本研究中，對(duì)該基因在貝殼損傷修復(fù)過程中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，馬氏珠母貝外套膜組織中的Kelch-like基因分別在貝殼受損后6、12、120 h時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)(圖5)。

圖5 Kelch-like在馬氏珠母貝損傷修復(fù)過程中的表達(dá)變化Fig.5 Change in expression level of Kelch-like gene in shell notching from pearl oyster Pinctada fucata martensii

2.6 Kelch-like基因SNP位點(diǎn)及單倍型

對(duì)馬氏珠母貝Kelch-like基因外顯子區(qū)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，共獲得56個(gè)SNP位點(diǎn)。使用PopGen 32軟件分析發(fā)現(xiàn)，各位點(diǎn)觀測雜合度為0.109 1～0.622 7，平均值為0.363 3，期望雜合度為0.103 4～0.500 1，平均值為0.330 2；39個(gè)SNP位點(diǎn)符合哈迪-溫伯格平衡；各位點(diǎn)多態(tài)性信息含量PIC為0.097 7～0.374 5，其中，25個(gè)SNP屬于低度多態(tài)，31個(gè)SNP屬于中度多態(tài)(表2)。

ME—邊緣膜；MP—套膜區(qū)；MC—中央膜；A—閉殼?。籉—足；GO—性腺;GI—鰓；HE—肝胰腺；B—血液；PS—珍珠囊。標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。ME—marginal zone;MP—mantle zone;MC—central mantle zone;A—adductor muscle;F—foot;GO—gonad;GI—gill;HE—hepatopancreas;B—hemocyte;PS—pearl sac.The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences,et sequentia.圖4 Kelch-like在馬氏珠母貝不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression level of Kelch-like gene in different tissues of pearl oyster Pinctada fucata martensii

表2 Kelch-like基因的SNP位點(diǎn)信息Tab.2 SNP information of Kelch-like gene

對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行單倍塊分析發(fā)現(xiàn)，有10個(gè)SNP位點(diǎn)形成了一個(gè)單倍塊，為4種單倍型(表3)。結(jié)合表型分析發(fā)現(xiàn)，單倍型AATCTGTCGG為優(yōu)異單倍型，其殼質(zhì)量顯著大于單倍型AGCCTACCGA和AGCCTACTTA(P<0.05)(圖6)。

表3 Kelch-like基因SNP位點(diǎn)單倍型分析Tab.3 SNP haplotype analysis of Kelch-like gene

圖6 Kelch-like單倍型與表型的關(guān)系Fig.6 Relationship between Kelch-like haplotype and phenotype

3 討論

3.1 馬氏珠母貝Kelch-like基因的序列特征

Kelch-like蛋白通常含有1個(gè)BTB/POZ結(jié)構(gòu)域、1個(gè)BACK結(jié)構(gòu)域和5～6個(gè)Kelch結(jié)構(gòu)域，但各個(gè)成員的構(gòu)成均不相同[1]。本研究中，馬氏珠母貝Kelch-like蛋白序列包括1個(gè)BTB結(jié)構(gòu)域、1個(gè)BACK結(jié)構(gòu)域和2個(gè)Kelch結(jié)構(gòu)域，這與上述的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果類似。BTB蛋白是E3泛素連接酶的橋頭蛋白，在果蠅Drosophilamelanogaster、小鼠Musmusculus及人類Homosapiens的進(jìn)化過程中均較為保守[11]；BTB結(jié)構(gòu)域具有促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)合及二聚化反應(yīng)的功能，BTB結(jié)構(gòu)域的正確折疊和形成的蛋白復(fù)合體是BTB蛋白具有正常轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的必要條件[12-13]。BTB蛋白具有抑制轉(zhuǎn)錄的功能，還可以通過對(duì)局部核小體的解旋和重新構(gòu)造而達(dá)到轉(zhuǎn)錄激活的作用[14-17]。BACK結(jié)構(gòu)域中保守的氨基酸包括N端的Asn-Cys-Leu-Gly-Lle、Val-Arg-[Leu/Met/Phe]-Pro-Leu-Leu和一些疏水氨基酸，BACK結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)蛋白的功能中發(fā)揮重要作用[18]。Kelch重復(fù)元件由4～7個(gè)Kelch構(gòu)象組成，每個(gè)Kelch構(gòu)象是由4條鏈組成的β折疊，包含44～56個(gè)氨基酸殘基[19]，具有8個(gè)關(guān)鍵的保守位點(diǎn)，包括4個(gè)疏水氨基酸，緊臨的是2個(gè)連續(xù)的Gly(GG)，隔開一段序列后是2個(gè)有固定間隔的芳香族氨基酸Y和W[20-21]。進(jìn)化保守的結(jié)構(gòu)意味著Kelch結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞骨架形態(tài)、基因表達(dá)調(diào)控及蛋白質(zhì)結(jié)合方面具有重要的生物學(xué)功能[1,20]。本研究中，對(duì)馬氏珠母貝Kelch-like的蛋白序列進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其BTB、BACK和Kelch結(jié)構(gòu)域在高級(jí)結(jié)構(gòu)上高度保守，且與美洲牡蠣和蝦夷扇貝的Kelch-like序列結(jié)構(gòu)高度相似。

3.2 馬氏珠母貝Kelch-like基因的表達(dá)模式

軟體動(dòng)物外套膜為貝殼礦化的主要組織，許多與礦化過程直接相關(guān)的分泌蛋白均在外套膜中大量表達(dá)并分泌到體外時(shí)行使其礦化功能[9]。軟體動(dòng)物外套膜在功能上存在區(qū)域性分工，一般認(rèn)為，外套膜邊緣區(qū)負(fù)責(zé)方解石結(jié)晶的棱柱層的形成，而套膜區(qū)和中央?yún)^(qū)則負(fù)責(zé)文石結(jié)晶的珍珠層的形成[22-23]。本研究中發(fā)現(xiàn)，馬氏珠母貝Kelch-like基因在外套膜邊緣區(qū)高表達(dá)，說明其可能參與貝殼棱柱層的形成過程?？蒲泄ぷ髡叱Ｓ萌睔p傷試驗(yàn)研究參與貝殼形成過程中的蛋白等大分子物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)貝殼進(jìn)行缺殼損傷后，櫛孔扇貝會(huì)立刻啟動(dòng)修復(fù)程序，再生損傷部位的貝殼，在此過程中參與貝殼礦化的蛋白表達(dá)量會(huì)產(chǎn)生明顯的變化[9]；馬氏珠母貝貝殼受到損傷后，CREB3L2基因和基質(zhì)蛋白的表達(dá)量會(huì)迅速上升，且CREB3L2基因的峰值出現(xiàn)更早，推測其通過影響基質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)錄，參與馬氏珠母貝生物礦化的調(diào)控過程[8]；貝殼損傷修復(fù)過程中幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)水平呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，暗示其作為負(fù)調(diào)控因子參與貝殼修復(fù)過程[24]。本研究中，在馬氏珠母貝貝殼損傷后6 h，Kelch-like基因出現(xiàn)高表達(dá)，暗示其在貝殼損傷修復(fù)過程中發(fā)揮了作用，進(jìn)一步說明其在貝殼礦化中的作用。

3.3 馬氏珠母貝Kelch-like的SNP位點(diǎn)分析

單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指基因組水平同一位置堿基變異而引起的DNA序列多態(tài)性，且SNP遺傳穩(wěn)定性好，通常被認(rèn)為是二等位基因分子標(biāo)記，有利于對(duì)其進(jìn)行基因分型[25]。Salem等[26]利用轉(zhuǎn)錄組獲得50 k的SNP芯片，鑒定獲得虹鱒Oncorhynchusmykiss肌肉含量相關(guān)數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTLs)，其中3個(gè)SNP位點(diǎn)位于候選基因Kelch protein 21，該基因通過調(diào)控細(xì)胞繁殖或分化在骨骼肌發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。Gonzalez-Pena等[27]對(duì)虹鱒出肉率性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)，發(fā)現(xiàn)出肉質(zhì)量相關(guān)聯(lián)位點(diǎn)注釋到Kelch domain-containing protein 8b基因。Jin等[28]利用250 k SNP芯片對(duì)鲇耐熱性進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，獲得了14個(gè)性狀相關(guān)候選基因，其中TRAF2、FBXW5、ANAPC2、UBR1和Kelch-like 29 5個(gè)基因通過參與泛素化過程在蛋白質(zhì)降解過程中發(fā)揮重要作用。單倍型是SNP沿染色體的物理排列，其提供的遺傳變異信息比SNP更能代表基因的多樣性[29]。本研究中，馬氏珠母貝Kelch-like基因單倍型AATCTGTCGG的殼質(zhì)量顯著大于單倍型AGCCTACCGA和AGCCTACTTA，說明該單倍型具有作為以殼質(zhì)量性狀為目標(biāo)的育種標(biāo)記的潛力，為進(jìn)一步進(jìn)行馬氏珠母貝優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的選育提供了參考依據(jù)。

4 結(jié)論

1)馬氏珠母貝Kelch-like基因在外套膜邊緣區(qū)顯著高表達(dá)，并參與貝殼損傷修復(fù)過程，說明其在貝殼礦化中發(fā)揮著重要作用。

2)馬氏珠母貝Kelch-like的單倍型AATCTGTCGG為優(yōu)異單倍型，該單倍型有望作為以殼質(zhì)量為目標(biāo)的育種標(biāo)記，該結(jié)果對(duì)于選育具有優(yōu)良性狀的馬氏珠母貝具有重要的理論意義。