尖孢鐮刀菌T-DNA插入突變體的篩選及插入基因分析

郭芳睿，劉 浥，楊柯昕，褚美榮，張全發(fā)，張雅菲，王樹桐，曹克強(qiáng)

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001；2.廊坊市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北 廊坊 065000)

尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是一種重要的植物病原菌，其寄主范圍廣泛[1-2]，國內(nèi)外已報(bào)道的有棉花、甘蔗、花生、香蕉、茄子、番茄、西瓜和大豆等[3-9]幾十種寄主植物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大損失。其次，尖孢鐮刀菌侵染蘋果植株根系造成蘋果再植病害，該病害在世界各地蘋果產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，是蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的巨大障礙，通常會導(dǎo)致再植蘋果幼樹根系發(fā)育異常，甚至死亡，產(chǎn)量下降，最終導(dǎo)致再植蘋果樹壽命縮短[10]，給蘋果生產(chǎn)造成了巨大損失，因此，防治蘋果再植病害的研究迫在眉睫。在植物病害流行與綜合防治研究室前期試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，老齡果園土壤中分離出的尖孢鐮刀菌是引起河北省蘋果再植病害的重要病原菌，但目前對其分子致病機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步研究。

目前，國內(nèi)外對引起蘋果再植病害的尖孢鐮刀菌研究較少，缺乏該病菌對蘋果樹致病分子機(jī)制的研究。隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATMT)在串珠鐮孢菌[11]和高山分枝桿菌[12]等多種植物[13]的病原菌上成功應(yīng)用，該方法已成為植物病原菌分子遺傳學(xué)研究的重要手段之一。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害流行與綜合防治研究室前期利用ATMT轉(zhuǎn)化建立了含有超過10 000個(gè)轉(zhuǎn)化子的尖孢鐮刀菌HS2菌株突變體庫，但這些轉(zhuǎn)化子是否成功插入了目的片段，在生物學(xué)性狀方面有哪些改變，是否有致病力發(fā)生變化的突變體，都還缺乏研究。經(jīng)鄒慶甲等[14]分析鑒定，確定尖孢鐮刀菌HS2菌株致病力強(qiáng)，引起蘋果再植病害典型癥狀。

本研究從該突變體庫中，隨機(jī)選取了300個(gè)轉(zhuǎn)化子，首先進(jìn)行了PCR檢測結(jié)合熒光顯微觀察，然后對PCR檢測陽性和顯微觀察到熒光信號的轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性、生長速率和產(chǎn)孢量等培養(yǎng)表型進(jìn)行了系統(tǒng)分析。采用海棠胚根作為試材，建立了突變體致病性快速檢測技術(shù)，對前期篩選的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行致病性測定。對致病力有顯著缺陷的8個(gè)突變體進(jìn)行了Southern雜交[15]以明確其插入拷貝數(shù)，采用熱不對稱嵌套PCR(TAIL-PLR)技術(shù)[16]對6個(gè)單拷貝插入突變體的T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行了分析，旨在為深入了解病原尖孢鐮刀菌的生長發(fā)育和致病分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：尖孢鐮刀菌HS2菌株及其T-DNA突變體菌株均來自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害流行與綜合防治研究室，T-DNA突變體是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所張俊祥博士惠贈的含有抗潮霉素基因和綠色熒光蛋白基因的雙元表達(dá)載體pCamhybgfp作為轉(zhuǎn)化供體所得。

致病性材料：發(fā)芽長度均勻一致的八棱海棠種子。

主要試劑：地高辛雜交檢測試劑盒Ⅰ、PCR DIG Primer Synthesis Mix試劑盒購自Roche公司，潮霉素B、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、LA TaqTM、DNA提取試劑盒、PMD19-T(+Simple)載體、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、TaKaRa Mini BEST瓊脂糖凝膠回收試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖 20 g，加水定容至1 L；水瓊脂(WA)培養(yǎng)基(用于致病性測定)：瓊脂20 g，葡萄糖3 g，加水定容至1 L。

儀器：T-gradient Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀，德國Biometra公司；BST-20M UVⅠ凝膠成像系統(tǒng)，ND1000，美國Gene公司；BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀，德國Eppendorf公司；電泳槽DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；DYCZ-24D型迷你雙垂直電泳槽，北京六一儀器廠；雜交爐，美國SIM INTERNATIONAL GROUP公司；OLYMPUS IX71熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 尖孢鐮刀菌菌株的培養(yǎng) 將保藏的尖孢鐮刀菌野生型菌株HS2及T-DNA突變體原始菌株分別接種到含有100 μg/mL的HygB、CM和AMP的PDA培養(yǎng)基和不含抗生素的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，26 ℃黑暗培養(yǎng)3 d后，再從菌落邊緣打菌餅(直徑6 mm)接種到PDA培養(yǎng)基上。

1.2.2 尖孢鐮刀菌基因組DNA的提取及突變體的PCR檢測 隨機(jī)選取300株突變體用于T-DNA插入的分子檢測，并以野生型菌株HS2及雙元載體為對照。采用CTAB法提取供試菌株的基因組DNA，使用核酸蛋白檢測儀測定DNA的濃度。使用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的特異性引物(序列為：HYG-F 5′-ATGAAAAAGCCTGAACTCAC-3′和HYG-R 5′-CTATTCCTTTGCCCTCG-3′[17](由生工生物工程(上海)股份有限公司合成))對突變體進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，理論擴(kuò)增片段長度為1 000 bp。PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：1 μL DNA(100 ng/μL)，12.5 μL Mix(2.5 mmol/L)，HYG-F(10 μmol/L)和HYG-R(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

1.2.3 尖孢鐮刀菌突變體的熒光顯微觀察 將經(jīng)過PCR檢測陽性的轉(zhuǎn)化子與HS2野生菌株在熒光顯微鏡下進(jìn)行對比觀察，在紫色激發(fā)光下以觀察到菌株的綠色熒光作為轉(zhuǎn)化成功的標(biāo)志。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性檢測 選取經(jīng)過PCR檢測和熒光顯微觀察驗(yàn)證過的突變體，連續(xù)在不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)5代后，再轉(zhuǎn)移到含有抗潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，從而確定外源基因已經(jīng)插入到尖孢鐮刀菌HS2基因組中且能夠穩(wěn)定遺傳。

1.2.5 尖孢鐮刀菌突變體的生長速率及產(chǎn)孢量測定 將野生菌株及其突變體菌株活化后的接種體轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上，從第2 天開始用十字交叉法每天測定菌落直徑，連續(xù)測定5 d，觀察生長速率的變化，每個(gè)菌株重復(fù)3次。

對經(jīng)過生長速率測定的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行產(chǎn)孢量測定。將轉(zhuǎn)化子及野生菌株分別接種至PDA培養(yǎng)基上，26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)6 d，然后在培養(yǎng)皿中加入10 mL無菌水，用刮勺輕輕刮下菌絲，并用滅菌的擦鏡紙過濾，配制分生孢子懸浮液，每個(gè)菌株重復(fù)3次，用血球計(jì)數(shù)器測量計(jì)算孢子濃度。

1.2.6 尖孢鐮刀菌突變體的致病性測定 利用胚根接種法對野生菌株HS2及其突變菌株進(jìn)行致病性測定。將轉(zhuǎn)化子在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，用打孔器從菌落生長邊緣打取菌餅，接種到WA培養(yǎng)基上，26 ℃培養(yǎng)2 d，待菌落長到培養(yǎng)皿約1/2時(shí)，挑取10個(gè)消毒滅菌后的八棱海棠種子均勻擺放到菌落周圍，同時(shí)用無菌PDA培養(yǎng)基作陰性對照，以野生菌株HS2作陽性對照。每個(gè)菌株重復(fù)3次，每天記錄胚根被侵染個(gè)數(shù)，7 d后測量并記錄胚根長度。

1.2.7 Southern雜交分析 為了驗(yàn)證致病力缺陷突變體的T-DNA的插入拷貝數(shù)，用引物HYG-F和HYG-R擴(kuò)增hph基因片段，用地高辛標(biāo)記方法制備探針，具體步驟參考地高辛DNA標(biāo)記檢測試劑盒的相關(guān)說明書。用CTAB 法對致病力缺陷的8個(gè)突變菌株及其野生菌株將溶解過夜的突變體DNA用Hind Ⅲ酶切，酶切純化產(chǎn)物通過在0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。在轉(zhuǎn)膜之前需用變性緩沖液處理凝膠，如制造商說明書所述，預(yù)雜交和雜交溫度為49 ℃，膜在68 ℃完成高度嚴(yán)格洗滌。其他步驟按照地高辛雜交檢測試劑盒Ⅰ和DIG-High Prime DNA標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)方案的規(guī)范進(jìn)行操作。

1.2.8 尖孢鐮刀菌突變體的側(cè)翼序列分析 采用TAIL-PCR技術(shù)對突變體側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，方法和引物設(shè)計(jì)參考陳紅運(yùn)等[18]和田蕾等[19]，擴(kuò)增所用的特異性引物是根據(jù)質(zhì)粒上抗潮霉素基因設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：1 μL DNA(100 ng/μL)，0.4 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，2 μL PCR Buffer(Mg2+plus)，1 μL AD引物(10 μmol/L)，0.2 μL FSP/RSP引物(10 μmol/L)，0.3 μLTaq酶(10 μmol/L)，15.1 μL ddH2O。TAIL-PCR總共包括3輪反應(yīng)程序，每一輪的反應(yīng)體系為20 μL，將第1輪和第2輪產(chǎn)物稀釋50倍后，各吸取1 μL的稀釋產(chǎn)物分別作為第2輪和第3輪的反應(yīng)模板。對所得到的第3輪目的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，并將回收產(chǎn)物與PMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞里，將提取好的質(zhì)粒送往華大基因測序部進(jìn)行測序，并根據(jù)測序結(jié)果對T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行分析。通過NCBI-Blast對側(cè)翼序列進(jìn)行比對分析，從而確定插入位置及其臨近的尖孢鐮刀菌的基因。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用 Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測

隨機(jī)選取300個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以野生菌株HS2和水作為陰性對照，以含有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌液作陽性對照，對其PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果顯示，290個(gè)轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出單一條帶(圖1)，與潮霉素抗性基因預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致。

M.DL2000 DNA Marker；WT.HS2；P.LBA4404；1—21.T-DNA插入轉(zhuǎn)化子。M.DL2000 DNA Marker；WT.HS2；P.LBA4404；1—21.T-DNA insertion transformant.

2.2 轉(zhuǎn)化子的熒光驗(yàn)證

用熒光顯微鏡對經(jīng)過PCR檢測的290個(gè)突變體進(jìn)行熒光觀察，結(jié)果顯示，有283株突變體的菌絲和分生孢子均能產(chǎn)生綠色熒光(圖2)，說明GFP基因已經(jīng)被含有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌整合到尖孢鐮刀菌的基因組。

明視觀察：A.野生菌株HS2，C.突變體菌絲；熒光觀察：B.野生菌株HS2，D.突變體菌絲。Bright field：A.HS2，C.Mutant mycelia；Fluorescence field：B.HS2，D.Mutant mycelia.

2.3 突變體穩(wěn)定性測定

使上述篩選獲得的283株突變體在不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接5代(圖3-A)后，發(fā)現(xiàn)所測試的突變體仍可以在濃度為100 μg/mL潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上正常生長(圖3-B)，并且菌落形態(tài)和顏色均未發(fā)生改變，這表明含有T-DNA的轉(zhuǎn)化子能夠穩(wěn)定遺傳，野生菌株HS2始終不可以在含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上生長。

野生菌株.H2S；突變菌株.HS2-232、HS2-211、HS2-174、HS2-47。Wild mycelia.H2S；Mutant mycelia.HS2-232，HS2-211，HS2-174，HS2-47.

2.4 突變體的生長速率及產(chǎn)孢量測定

對283個(gè)穩(wěn)定遺傳生長的突變體進(jìn)行生長速率和產(chǎn)孢量測定，部分突變體與野生型菌株相比有顯著差異(P<0.05)，在生長速率減慢的突變體中，突變體HS2-2109、HS2-100、HS2-908生長速率顯著減慢(表1)。在產(chǎn)孢減少的突變體中，突變體HS2-101、HS2-1016、HS2-2109下降最為顯著，而突變體HS2-2229則未產(chǎn)孢(表2)。

表1 部分轉(zhuǎn)化子菌落直徑(接種后5 d)Tab.1 Colony size of several transformants(5 d after inoculation)

表2 部分轉(zhuǎn)化子的單位面積產(chǎn)孢量(6 d)Tab.2 The number sporulation per unit area of several mutants(6 d after inoculation)

2.5 突變體致病力測定

對其中223株遺傳穩(wěn)定且經(jīng)過產(chǎn)孢量和生長速率測定的突變體進(jìn)行致病性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12.1%突變菌株致病力增加，87.9%突變菌株致病力減弱；在致病力減弱的突變體中，HS2-520、HS2-1016和HS2-2109幾乎喪失了致病性(表3和圖4)。

表3 部分轉(zhuǎn)化子的致病力Tab.3 The pathogenicity of several mutants

A.HS2；B.HS2-1016；C.HS2-520；D.HS2-2109。

2.6 致病力減弱突變體插入拷貝數(shù)的測定

本試驗(yàn)探針標(biāo)記采用的是地高辛PCR標(biāo)記，插入目的片段為1 000 bp，經(jīng)過地高辛標(biāo)記片段較原始目的片段大200 bp左右(圖5)，標(biāo)記成功。對致病力明顯缺陷的8個(gè)突變菌株進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果表明，HS2-1016、HS2-520、HS2-2109、HS2-511、HS2-100和HS2-2460為單拷貝插入菌株，HS2-2525為雙拷貝插入菌株(圖6)。

M.Marker 2000；1—3.探針；4.水；5—6.農(nóng)桿菌；7—8.突變體；9.水。M.Marker 2000；1—3.Probe；4.H2O；5—6.Agrobacterium tumefaciens；7—8.Mutants；9.H2O.

M.1 kb DNA Ladder；1—8.HS2-2525、HS2-100、HS2-1016、HS2-520、HS2-2109、HS2-511、HS2-311、HS2-2460；9.HS2；10.質(zhì)粒。M.1 kb DNA Ladder；1—8.HS2-2525，HS2-100，HS2-1016，HS2-520，HS2-2109，HS2-511，HS2-311，HS2-2460；9.HS2；10.Plasmid.

2.7 尖孢鐮刀菌突變體的側(cè)翼序列分析

利用特異性引物和8條隨機(jī)引物對致病力減弱、表型有變化且有T-DNA插入的8株突變體(HS2-2109、HS2-520、HS2-2525、HS2-1016、HS2-511、HS2-311、HS2-100和HS2-2460)進(jìn)行TAIL-PCR，將擴(kuò)增出的第3輪條帶進(jìn)行回收測序。

以左右邊界的FSP、RSP特異性引物與AD1～AD8隨機(jī)引物進(jìn)行組合，對8株突變體進(jìn)行了TAIL-PCR擴(kuò)增，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的片段，經(jīng)過膠回收，連接轉(zhuǎn)化，菌落PCR驗(yàn)證后(圖7)，經(jīng)公司測序，最終12條側(cè)翼序列測序成功，與野生菌株HS2基因組序列比對后，發(fā)現(xiàn)其中9條為載體質(zhì)粒序列，3條為克隆得到的側(cè)翼序列。TAIL-PCR擴(kuò)增得到的突變體側(cè)翼序列經(jīng)過Blast比對，基因功能注釋結(jié)果表明，HS2-100的插入位點(diǎn)位于Contig 000006的454位置，突變基因?yàn)镕OIG-04323，編碼假定蛋白。HS2-2460插入位點(diǎn)位于Contig 000008的740與741基因之間，該位置的上游基因?yàn)閍sp1基因，所編碼的蛋白是二磷酸肌醇多磷酸水解酶 aps1；它的下游基因?yàn)槲粗?，所編碼的蛋白是假定蛋白FOXB-06474(表4)。

表4 側(cè)翼序列與HS2全基因組序列比對結(jié)果Tab.4 Sequence alignment result of flanking sequences and HS2 in genome

3 結(jié)論與討論

從真菌T-DNA插入突變體庫中篩選致病缺陷突變體的方法因真菌種類和寄主植物的不同而存在很大的差異。目前主要包括噴施或注射孢子懸浮液法以及菌餅反接針刺離體葉片法。本研究使用的HS2菌株為從蘋果樹根部分離獲得的具有較高致病力的尖孢鐮刀菌。蘋果樹根部其實(shí)為其砧木，河北省一般以八棱海棠作為蘋果砧木。而對果樹根部病害進(jìn)行致病性測定耗時(shí)漫長，癥狀觀察困難，不同批次間試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性較差。因此，本研究在前期工作基礎(chǔ)上，采用了胚根接種法進(jìn)行致病性測定。在前期研究中，通過與大田試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)胚根接種與其他2種方法的測定結(jié)果基本一致，而用于致病性測定時(shí)，胚根接種法較為簡便快捷，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性好，且便于結(jié)果觀察和測量，從而保證了本研究對突變體致病性測定的快速開展[20]。

本研究結(jié)果顯示，在供試的300株突變體中，除少數(shù)突變體外，大部分菌株在菌落形態(tài)、菌絲生長速率、繁殖體形成及致病力等方面與野生型菌株HS2無明顯差異，這與梁曼等[21]、馮浩等[22]在大麗輪枝菌和蘋果樹腐爛病菌中的研究結(jié)果一致。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的根本原因有：外源T-DNA插入病菌的基因組是隨機(jī)的，雖然T-DNA的插入位點(diǎn)有一定概率引起病菌表型或致病力發(fā)生明顯變化，但大多數(shù)情況下T-DNA所破壞的基因與表型、致病力間并無明顯的對應(yīng)關(guān)系；表型及致病力的改變還受供試病菌的株系、轉(zhuǎn)化體系及插入拷貝數(shù)等諸多因素的影響。

本研究通過TAIL-PCR試驗(yàn)，獲取了T-DNA的側(cè)翼序列確定外源基因的插入位點(diǎn)，但是有研究表明，通過農(nóng)桿菌遺傳介導(dǎo)轉(zhuǎn)化將T-DNA插入真菌細(xì)胞中時(shí)，會獲得目的片段序列，也可能是獲得載體序列[23]。本研究對致病力明顯缺陷的8個(gè)突變菌株進(jìn)行Southern雜交，獲得6株單拷貝克隆菌株。對8株突變體進(jìn)行了TAIL-PCR克隆，共獲得15條側(cè)翼序列，其中有12條序列測序成功，經(jīng)過序列比對發(fā)現(xiàn)有9條序列為載體序列，3條序列為假定蛋白。TAIL-PCR擴(kuò)增得到的突變體側(cè)翼序列經(jīng)過Blast比對，明確了突變體HS2-100和HS2-2460的插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，但HS2-2460的上游基因已知，可以進(jìn)行下一步的研究。這些序列可能為新的、或者特異的致病基因序列或是啟動子區(qū)域序列，為深入了解尖孢鐮刀菌相關(guān)表型發(fā)育或與致病性相關(guān)基因研究提供新的研究材料。本研究獲得了類型豐富的表型及致病突變體，為尖孢鐮刀菌功能基因組研究提供了良好試材，也為該病菌基因組范圍內(nèi)大規(guī)模功能基因的發(fā)掘和鑒定奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。