大豆主莖木質(zhì)素積累規(guī)律分析

李艷燕，趙彩桐，齊陽陽，劉 明，張書瑞，劉志華，李文濱，姜振峰

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部東北大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

木質(zhì)素是苯丙烷衍生物通過化學(xué)鍵形成的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物細(xì)胞壁，占植物細(xì)胞壁干質(zhì)量的16%～35%[1-2]。木質(zhì)素能夠提高細(xì)胞壁硬度、機(jī)械支持力、抗壓強(qiáng)度，還能促進(jìn)機(jī)械組織形成，是影響細(xì)胞壁強(qiáng)度和莖稈抗倒伏性的關(guān)鍵因素[3-5]。水稻[6]、小麥[7]、蕎麥[8]、大豆[9]、燕麥[10]、油菜[11]的相關(guān)研究表明，木質(zhì)素含量高的莖稈，其機(jī)械強(qiáng)度高，抗倒伏性強(qiáng)。小麥莖稈木質(zhì)素研究結(jié)果表明，木質(zhì)素在主莖底部第2節(jié)間的積累量和莖稈的抗折強(qiáng)度及抗倒伏指數(shù)呈正相關(guān)，是小麥植株在成熟期倒伏面積的負(fù)影響因子，表明提高小麥莖稈的木質(zhì)素含量能改善莖稈的抗折力，進(jìn)而增強(qiáng)小麥植株的抗倒伏性并且降低小麥倒伏風(fēng)險(xiǎn)[12]。甘藍(lán)型油菜主莖的木質(zhì)素含量和莖稈抗折力間也呈顯著正相關(guān)關(guān)系，表明提高主莖木質(zhì)素含量，能夠增加植物主莖的機(jī)械強(qiáng)度，進(jìn)而改良莖稈的抗折性[13]。另外，主莖型甜蕎木質(zhì)素含量和莖稈抗倒伏性密切相關(guān)，高抗倒伏品種在各生育時(shí)期的木質(zhì)素含量和莖稈抗折力都高于抗倒伏較低的其他品種[14]。植物莖稈木質(zhì)素含量受酶活性調(diào)控。小麥莖稈木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性變化影響木質(zhì)素含量，最終導(dǎo)致抗折力和抗倒伏指數(shù)變化[15]。青稞抗倒伏品種的主莖較短，4-香豆酸：輔酶A連接酶(4CL)、肉桂醇脫氫酶(CAD)和苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)活性較高，主莖中的木質(zhì)素積累較多，莖稈抗折力提高，抗倒伏能力改善[16]。

大豆節(jié)間的木質(zhì)素含量能夠增強(qiáng)植株中細(xì)胞壁強(qiáng)度和莖稈的抗彎折力，為植株提供結(jié)構(gòu)支持[17]。因此，大豆節(jié)間的木質(zhì)素含量是影響抗倒伏性的重要因素，是大豆抗倒伏性強(qiáng)弱的重要生理指標(biāo)，是保證大豆產(chǎn)量的重要性狀。前人研究了木質(zhì)素的合成、在植物體內(nèi)分布情況、木質(zhì)素合成酶基因家族功能等[17]，但對木質(zhì)素在大豆節(jié)間的積累規(guī)律、木質(zhì)素合成酶基因的表達(dá)模式及代謝物積累規(guī)律并不明確。因此，本研究通過測定大豆節(jié)間4CL、PAL、CAD這3種木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶活性以及木質(zhì)素含量，明確大豆節(jié)間木質(zhì)素積累規(guī)律，旨在為深入理解木質(zhì)素積累與抗倒伏間關(guān)系以及調(diào)控大豆植株表型提供參考依據(jù)，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上判斷大豆生長關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)并采取有針對性的調(diào)控措施提供理論基礎(chǔ)，為抗倒伏高產(chǎn)大豆新品種培育提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆品種Charleston由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供。Charleston為有限生長習(xí)性，適合窄行密植栽培，分枝較多，抗倒伏性較強(qiáng)[18-20]，但是高密度種植條件導(dǎo)致植株節(jié)間明顯伸長，植株抗倒伏性明顯降低[21]，是分析大豆主莖木質(zhì)素相關(guān)指標(biāo)在密度影響下變化規(guī)律的適合材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料播種 木質(zhì)素染色和含量相關(guān)酶及含量分析材料：試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)盆栽場(東經(jīng)126.68°，北緯45.72°)。選取盆栽場內(nèi)陽光無遮擋地塊作為試驗(yàn)用地，保證光照充足均勻。2019年5月20日，將種子均勻點(diǎn)播在40 cm直徑盆栽桶內(nèi)，根據(jù)黑龍江南部和北部地區(qū)大豆主栽品種的種植密度選定株數(shù)。每個品種分別按照20，35株/m2篩選長勢一致的幼苗10株分別掛牌標(biāo)記。生長期間，采用人工定量澆灌的方式供應(yīng)水分，保證植株正常生長發(fā)育。

基因表達(dá)和代謝物含量分析材料：將種子在75%乙醇(V/V)中滅菌，種在裝滿黑土的缽中放在培養(yǎng)箱至第1個三出復(fù)葉完全展開，培養(yǎng)箱光照條件為光照16 h，黑暗8 h；光照溫度為30 ℃，黑暗為20 ℃，光強(qiáng)為500 μmol/(m2·s)。取至少10株沒有葉和葉柄的主莖作為1個樣品。收獲大豆AS(帶有少量幼葉)、EZ(1 cm的莖距AS切取0.5 cm)和MZ(從次生區(qū)域至下一個節(jié)點(diǎn)切取0.5 cm)的樣品，在液氮中迅速冷凍，然后儲存在-80 ℃進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.2 木質(zhì)素含量測定 參照任夢露[22]的方法，采用紫外分光光度計(jì)法測定木質(zhì)素含量。取大豆植株的第2～6段主莖，稱取每個莖段總質(zhì)量，然后稱0.1 g鮮樣放入研缽中(若質(zhì)量多于所需要求，需從上至下均勻減取，若少于所需質(zhì)量，則重新選取樣品)。加入適量石英砂和95%乙醇，研磨至勻漿后轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，經(jīng)4 500 r/min離心10 min，倒出上清液，收取沉淀。在EP管中加入適量的95%乙醇清洗沉淀物3次，再用乙醇∶正己烷=1∶1(V/V)的混合液沖洗3次，收取沉淀物，將沉淀物放入通風(fēng)櫥中等待其徹底干燥。在裝有干燥沉淀物的EP管中加入0.2 mL 25%的溴乙酰(冰醋酸配置)溶液溶解，蓋好EP管蓋，將其置于70 ℃水浴鍋中保溫30 min，每10 min顛倒混勻1次，保證藥品與沉淀充分接觸。加入0.16 mL 2 mol/L NaOH 終止反應(yīng)。再加入2 mL冰醋酸和0.04 mL 7.5 mol/L的鹽酸羥胺，混合均勻。放入離心機(jī)中轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心5 min，取上清液0.1 mL，加入3.0 mL冰醋酸稀釋。在OD280nm處測定吸收值，以O(shè)D280/g表示木質(zhì)素含量(以鮮質(zhì)量計(jì))。

1.2.3 間苯三酚染色 取Charleston主莖形態(tài)學(xué)上端至下端的1，2，3節(jié)，在每個莖段的上、中、下3個位置進(jìn)行徒手切片，將切取的橫切面薄片放置于載玻片上。在薄片上滴加1%間苯三酚溶液(95%乙醇配置)，染色2 min。再滴加25% HCl顯色2 min。將顯色完成的樣品放置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 4-香豆酸：輔酶A連接酶(4CL)活性(以鮮質(zhì)量計(jì))測定 樣本制備：分別取Charleston主莖第2～4節(jié)約0.135 g，加入1 mL提取液(購自蘇州格銳思生物科技有限公司)在冰浴條件下研磨勻漿。將磨碎的組織放入4 ℃預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，于12 000 r/min程序下離心10 min；離心完成后迅速吸取上清液，將上清液放置于冰上待測?；钚詸z測：將預(yù)熱30 min的紫外分光光度計(jì)波長調(diào)節(jié)至333 nm，并用蒸餾水調(diào)零。所有試劑放置于室溫中。在1 mL石英比色皿中按照表1依次加入試劑。

表1 4CL活性測定方法Tab.1 Method procedure for 4CL activity

將藥品混勻后，立即將樣品于室溫(25 ℃)條件下放入紫外分光光度計(jì)中，于333 nm處讀取吸光值A(chǔ)1，50 min后再讀取A2，ΔA=A2-A1。

4CL(U/g)=ΔA÷(W×V1÷V) ÷0.01÷T

①

式中，V為加入的提取液體積(mL)；V1為加入樣本體積(mL)；T為反應(yīng)時(shí)間(min)；W為樣本質(zhì)量(g)。

1.2.5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性(以鮮質(zhì)量計(jì))測定 樣本制備：分別取Charleston主莖第2～4節(jié)約0.135 g，加入1 mL提取液(購自蘇州格銳思生物科技有限公司)在冰浴條件下研磨勻漿。將磨碎的組織放入4 ℃預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，12 000 r/min離心10 min；迅速吸取上清液，放置于冰上待測。上機(jī)檢測：將預(yù)熱30 min的紫外分光光度計(jì)波長調(diào)節(jié)至290 nm，并用蒸餾水調(diào)零。

PAL(U/g)=ΔA÷(W×V1÷V)÷0.01÷T

②

式中，V為加入提取液體積(mL)；V1為加入樣本體積(mL)；T為反應(yīng)時(shí)間，(min)；W為樣本質(zhì)量(g)。

1.2.6 肉桂醇脫氫酶(CAD)活性(以鮮質(zhì)量計(jì))測定 樣本制備：分別取Charleston主莖第2～4節(jié)約0.135 g，加入1 mL提取液(購自蘇州格銳思生物科技有限公司)，在冰浴條件下研磨勻漿。將磨碎的組織放入4 ℃預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，12 000 r/min離心15 min。離心完成后迅速吸取上清液，放置于冰上待測。檢測：將紫外分光光度計(jì)波長調(diào)節(jié)至450 nm，設(shè)定溫度37 ℃，用蒸餾水調(diào)零，所有試劑放在37 ℃金屬浴中預(yù)熱5 min。

CAD(U/g)=((ΔA-0.007 4)÷2.434 3×V1×103)÷(W×V1÷V)÷T

③

式中，V為加入提取液體積(mL)；V1為加入樣本體積(mL)；T為反應(yīng)時(shí)間(min)；W為樣本質(zhì)量(g)。

1.2.7 大豆主莖代謝物和基因表達(dá)分析 大豆主莖代謝物和基因分析：具體方法見Jiang等[23]。樣品在30 Hz下冷凍研磨(MM 400，Retsch)后在4 ℃下萃取過夜(1.0 mL 70%的甲醇水溶液)。然后將提取物用CNWBOND Carbon-GCB SPE柱(ANPEL，250 mg，3 mL，中國上海)吸收并過濾(SCAA-104，0.22 μm孔徑；ANPEL，中國上海)。將樣品提取物注射到LC-ESI-MS/MS系統(tǒng)(API 6500 QTRAP LC/MS/MS System，美國熱電)鑒定代謝物。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果計(jì)算每個樣品的峰面積。以對數(shù)2倍變化(FC)公式計(jì)算AS和EZ之間或EZ和MZ之間的峰面積比值，以比較鑒定出的代謝物的豐度差異。公式為log2FC=log2B-log2A，值>1.5為差異顯著，B和A代表在大豆莖的3個部分中鑒定出的代謝產(chǎn)物。

大豆主莖基因分析：具體方法見Jiang等[23]。用熱酚法提取大豆莖RNA，送北京諾禾致源有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表分析。用Photoshop 7.0軟件進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆主莖節(jié)間的間苯三酚染色分析

2.1.1 高密度處理下主莖節(jié)間的染色分析 因大豆主莖同時(shí)處于生長狀態(tài)的節(jié)段一般只有3節(jié)，因此本研究選取高密度處理下Charleston(CH)品種形態(tài)學(xué)從上向下的第1，2，3節(jié)主莖，并在每節(jié)的上、中、下3個位置進(jìn)行切片取樣，選取平整的薄片進(jìn)行間苯三酚染色，在顯微鏡下觀察并拍照(圖1)。

A、B、C分別為第1節(jié)莖段的上、中、下3個部位染色結(jié)果；D、E、F分別為第2節(jié)莖段的上、中、下3個部位染色結(jié)果；G、H、I分別為第3節(jié)莖段的上、中、下3個部位染色結(jié)果。圖2同。

結(jié)果顯示，Charleston莖中的木質(zhì)素被染成紅色，間苯三酚染色的顏色越深，則對應(yīng)的木質(zhì)素含量越高。從圖1可以看出，莖中木質(zhì)素存在的木質(zhì)部位置，顯示大豆主莖由生長點(diǎn)向下逐漸木質(zhì)化的規(guī)律。從圖中可明顯觀察到莖中木質(zhì)素含量顏色變化，即同一莖段上部顏色比下部顏色淺，形態(tài)學(xué)上端莖段比下端莖段顏色淺；染色范圍從上至下逐漸增加，即主莖木質(zhì)素含量從上至下逐漸升高。

2.1.2 低密度處理下主莖節(jié)間的染色分析 同一莖段木質(zhì)素的染色結(jié)果由上至下顏色逐漸加深，形態(tài)學(xué)上端莖段比下端莖段顏色淺，染色范圍從上至下逐漸增加，即主莖木質(zhì)素含量從上至下逐漸升高(圖2)。比較高密度和低密度處理下Charleston主莖間苯三酚染色結(jié)果，可以看出從顏色深淺及染色范圍判斷，木質(zhì)素含量CL>CH，此結(jié)果與木質(zhì)素含量測定結(jié)果一致。

圖2 低密度處理下Charleston主莖間苯三酚染色Fig.2 Resorcinol staining results of stem of Charleston under low density condition

2.2 主莖節(jié)間木質(zhì)素含量分析

高密度處理(CH)莖中木質(zhì)素含量(以鮮質(zhì)量計(jì))由莖2～莖6依次升高，分別為1.334，2.259，2.493，3.392，4.083 OD280/g；低密度處理(CL)莖中木質(zhì)素含量由莖2～莖6依次升高，分別為1.481，2.475，2.588，3.049，4.191 OD280/g(圖3-A)。早期試驗(yàn)結(jié)果表明，形態(tài)學(xué)上部第3節(jié)的主莖發(fā)育變化最明顯，可以分為伸長區(qū)(EZ)和成熟區(qū)(MZ)[21]，因此，本研究對第3節(jié)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，莖3中木質(zhì)素含量MZ>EZ(圖3-B)。木質(zhì)素與莖稈的強(qiáng)度和抗倒伏能力密切相關(guān)。

A.Charleston不同節(jié)間木質(zhì)素含量：CH.高密度Charleston，CL.低密度Charleston；B.莖3中EZ、MZ中木質(zhì)素含量：EZ.細(xì)胞伸長區(qū)，MZ.次生細(xì)胞壁成熟區(qū)，HⅢ.高密度處理下DN594莖3，LⅢ.低密度處理下Charleston莖3。圖中不同小寫字母表示差異顯著(Duncan′s法，P<0.05)。圖4—6同。

2.3 主莖節(jié)間木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因代謝產(chǎn)物分析

大豆主莖木質(zhì)素代謝途徑產(chǎn)物，如松柏醛和松柏醇，在頂芽(AS)中顯示最低的豐度，與松柏醇相關(guān)的酶基因CCR在MZ與EZ中表達(dá)并無顯著差異，而直接參與催化合成松柏醛的CAD基因表達(dá)量，在次生細(xì)胞壁成熟區(qū)(MZ)中高于細(xì)胞伸長區(qū)(EZ)中表達(dá)量，并且從EZ到MZ逐漸升高，表明從松柏醛到松柏醇的代謝活性活躍在大豆莖的整個生長發(fā)育過程。除此之外，肉桂酸在AS中豐度高于EZ，3個相關(guān)酶基因差異表達(dá)較為明顯，其中Glyma.13g145000、Glyma.20g180800表達(dá)量在MZ中高于EZ，EZ中Glyma.03g181600的表達(dá)量高于MZ，說明PAL同時(shí)由多個表達(dá)方向的基因共同調(diào)控(表2)。

表2 高密度條件下苯丙烷合成途徑代謝物含量及顯著表達(dá)基因Tab.2 Metabolite content of phenylpropane synthesis pathway and related genes under high density conditions

2.4 主莖節(jié)間木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因表達(dá)量及酶活性分析

2.4.1PAL基因表達(dá)量及酶活性分析 高密度處理下，主莖第3節(jié)差異表達(dá)PAL基因中，Glyma.20g180800在MZ中的表達(dá)量比EZ高3.93倍，Glyma.13g145000在MZ的表達(dá)量比EZ高12.69倍。Glyma.03g181600在EZ的表達(dá)量比MZ高8.32倍。總體看來，多數(shù)PAL基因在MZ表達(dá)量高于EZ(圖4-A)。

如圖4-B所示，低密度處理下莖中PAL活性(以鮮質(zhì)量計(jì))顯著高于高密度處理(P<0.05)，高密度處理下莖2～莖4中PAL活性分別為15.563，51.379，61.047，63.054 U/g ；低密度處理下莖2～莖4中PAL活性分別為60.364，93.052，99.383，108.711 U/g，差異顯著。高密度處理下莖中PAL活性隨著莖的生長發(fā)育不斷升高，莖Ⅲ1中酶活性比莖Ⅱ高230.13%，莖Ⅲ2中酶活性比莖Ⅲ1高18.82%，莖Ⅳ中酶活性比莖Ⅲ2高3.29%。莖2中酶活性最低，莖4中酶活性最高。莖2與莖Ⅲ1中酶活性差異最大，后期活性增長較慢。低密度處理下莖中PAL活性隨著莖的生長發(fā)育不斷升高，莖Ⅲ1中酶活性比莖Ⅱ高54.15%，莖Ⅲ2中酶活性比莖Ⅲ1高6.80%，莖Ⅳ中酶活性比莖Ⅲ2中高9.39%。莖2中酶活性最低，莖4中酶活性最高。莖2與莖Ⅲ1中活性差異最大，后期活性增長較慢。整體看來，2個密度處理下莖中PAL活性變化規(guī)律較為一致，反映出莖中PAL活性變化規(guī)律，并且高密度處理下第3節(jié)莖中PAL活性存在差異，與基因的差異表達(dá)相對應(yīng)。

A.高密度處理下Charleston第3節(jié)莖EZ、MZ中PAL基因表達(dá)量；B.高低密度處理下Charleston莖中PAL活性：Ⅱ.第2節(jié)間，Ⅲ1.第3節(jié)間EZ，Ⅲ2.第3節(jié)間MZ，Ⅳ.第4節(jié)間。圖5—6同。A.PAL gene expression levels of EZ and MZ in stem of Charleston section 3 under high density treatment；B.PAL activity in stem of Charleston treated with high and low density：Ⅱ.The second internode，Ⅲ1.The third internode EZ，Ⅲ2.The third internode MZ，Ⅳ.The fourth internode.The same as Fig.5—6.

2.4.24CL基因表達(dá)量及酶活性分析 在高密度處理下主莖第3個節(jié)間中，Glyma.13g372000在MZ的表達(dá)量比EZ高3.53倍，Glyma.17g064600在MZ的表達(dá)量比EZ高1.17倍。Glyma.13g095600在MZ與EZ中表達(dá)量無顯著差異?？傮w看來，4CL基因在MZ表達(dá)量高于EZ(圖5-A)。

A.高密度處理下Charleston第3節(jié)莖EZ、MZ中4CL基因表達(dá)量；B.高低密度處理下Charleston莖中4CL活性。A.4CL gene expression levels of EZ and MZ in stem of Charleston section 3 under high density treatment；B.4CL activity in stem of Charleston treated with high and low density.

低密度處理下莖中4CL活性(以鮮質(zhì)量計(jì))顯著高于高密度處理(圖5-B)(P<0.05)，高密度處理下莖2～莖4中4CL活性分別為2.162，3.474，4.494，7.178 U/g；低密度處理下莖2～莖4中4CL活性分別為2.742，4.911，4.097，8.076 U/g，莖Ⅲ中差異顯著。高密度處理下莖中4CL活性隨著莖的生長發(fā)育不斷升高，莖Ⅲ1中酶活比莖Ⅱ高60.67%，莖Ⅲ2中酶活比莖Ⅲ1高5.78%，莖Ⅳ中酶活性比莖Ⅲ2高1.05倍。莖2中酶活性最低，莖4中酶活性最高。莖Ⅳ與莖Ⅲ2中酶活性差異最大，后期酶活性增長較快。低密度處理下莖的中4CL活性隨著莖的生長發(fā)育不斷升高，莖Ⅲ1中酶活比莖Ⅱ高79.08%，莖Ⅲ2中酶活比莖Ⅲ1高-16.56%，莖Ⅳ中酶活性比莖Ⅲ2高97.10%。莖2中酶活性最低，莖4中酶活性最高。莖Ⅳ與莖Ⅲ2中酶活性差異最大，后期活性增長較快。整體看來，2個密度處理下莖中4CL活性變化規(guī)律基本一致，同時(shí)也與基因的表達(dá)結(jié)果相符合。

2.4.3CAD基因表達(dá)量及酶活性分析 高密度處理下主莖第3個節(jié)間中，Glyma.15g059500在MZ的表達(dá)量比EZ表達(dá)量高66.00%，Glyma.20g128600在MZ的表達(dá)量比EZ高248.75%。Glyma.14g221200在EZ中有少量表達(dá)(圖6-A)。

觀察酶活性結(jié)果(圖6-B)可知，低密度處理下莖中CAD活性(以鮮質(zhì)量計(jì))高于高密度處理，高密度處理下莖2～莖4中CAD活性分別為0.522，0.599，0.648，1.156 U/g；低密度處理下莖2～莖4中CAD活性分別為0.628，0.817，1.122，1.522 U/g，Ⅱ和Ⅲ2節(jié)段差異顯著。單獨(dú)觀察2個密度處理下莖中CAD活性，高密度處理下莖的中CAD活性隨著莖的生長發(fā)育不斷升高。莖Ⅲ1中酶活比莖Ⅱ高14.75%，莖Ⅲ2中酶活比莖Ⅲ1高8.17%，莖Ⅳ中酶活性比莖Ⅲ2高78.31%。莖2中酶活性最低，莖4中活性最高。莖Ⅳ與莖Ⅲ2中酶活性差異最大，后期活性增長較快。低密度處理下莖中PAL活性隨著莖的生長發(fā)育不斷升高，莖Ⅲ1中酶活比莖Ⅱ高30.17%，莖Ⅲ2中酶活比莖Ⅲ1高37.33%，莖Ⅳ中酶活性比莖Ⅲ2高35.61%。莖2中酶活性最低，莖4中酶活性最高。莖Ⅲ1與莖Ⅲ2中酶活性差異最大，后期活性增長較快。整體看來，2個密度處理下Charleston莖中CAD活性變化規(guī)律較為一致，與基因表達(dá)結(jié)果相符合。

A.高密度處理下Charleston第3節(jié)莖EZ、MZ中CAD基因表達(dá)量；B.高低密度處理下Charleston莖中CAD活性。A.CAD gene expression levels of EZ and MZ in stem of Charleston section 3 under high density treatment；B.CAD activity in stem of Charleston treated with high and low density.

3 結(jié)論與討論

大豆倒伏無法使用機(jī)械收割，產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)損失不容小覷。大豆抗倒伏能力與基部節(jié)間的健壯程度密切相關(guān)?；抗?jié)間的形態(tài)結(jié)構(gòu)與內(nèi)在物質(zhì)含量影響抗倒性能，但化學(xué)成分是影響的內(nèi)在原因。木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁重要組成成分，不僅發(fā)揮著防止水分和營養(yǎng)物質(zhì)滲出細(xì)胞以外的作用，還決定著細(xì)胞硬度和強(qiáng)度。崔海巖等[24]研究中指出，木質(zhì)素直接影響莖稈強(qiáng)度，高抗倒伏品種木質(zhì)素含量和抗彎折能力均大于中抗倒伏品種和易抗倒伏品種。袁圓等[25]研究表明，木質(zhì)素含量增加，油菜抗倒性能較好，較高的木質(zhì)素含量改善了莖稈的組織結(jié)構(gòu)，提高抗倒性達(dá)到增產(chǎn)效果。

種植密度是影響大豆產(chǎn)量和抗倒伏性的關(guān)鍵因素。種植密度過大，大豆株高增加，重心高度上移，莖稈細(xì)軟，大豆抗倒伏能力下降。低密度有助于大豆抗倒伏性能增加。本研究通過比較大豆品種種植密度在20，35株/m2下的木質(zhì)素含量發(fā)現(xiàn)，低密度處理主莖中的木質(zhì)素含量比高密度處理高。低密度大豆更耐倒伏。邵慶勤等[26]研究指出，同一品種小麥種植密度增加后，株高、重心高度均增加，莖稈中木質(zhì)素含量降低，莖稈機(jī)械程度下降，倒伏指數(shù)增加，倒伏程度加大。木質(zhì)素含量的多少與植株的抗倒伏息息相關(guān)，高含量的木質(zhì)素更耐倒伏[14]。熊淑萍等[27]研究認(rèn)為，莖稈中的內(nèi)含物組成和比例是改善莖稈抗倒伏性能的重要原因。本研究結(jié)果支持這一結(jié)論，因?yàn)榇蠖拱l(fā)育節(jié)間的木質(zhì)素從形態(tài)學(xué)上端到下端逐漸升高，通過提高大豆發(fā)育莖中的木質(zhì)素基因表達(dá)量，提高大豆莖稈中的木質(zhì)素含量，最終提高高密度大豆莖稈抗倒伏性，達(dá)到增加產(chǎn)量的目的。

大豆植株主莖中木質(zhì)素含量受木質(zhì)素合成途徑中的多種酶調(diào)控。木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶基因多以基因家族形式存在，同一基因家族中的酶基因在同一物種植株的相同部位表達(dá)存在差異，同一基因在同一物種的不同組織和器官中的表達(dá)情況也不盡相同。如PAL基因家族中PAL1、PAL2、PAL3在擬南芥中表達(dá)的情況為AtPAL1和AtPAL2均在根、莖和葉中表達(dá)，但AtPAL2的表達(dá)量低于AtPAL1，而AtPAL3只在生長10 d的幼苗和成熟植物根中表達(dá)[28]。PAL家族在不同組織和器官中差異表達(dá)這一現(xiàn)象在水稻和大豆中得到了證明[29-30]。本研究的PAL基因在大豆發(fā)育節(jié)間的伸長區(qū)和成熟區(qū)不完全同向表達(dá)。對高密度處理下第3節(jié)莖的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，GmPAL的3個酶基因中有2個在MZ中表達(dá)量高于EZ，1個基因在EZ中表達(dá)量高于MZ。對不同密度處理下主莖進(jìn)行PAL、4CL、CAD活性分析顯示，主莖中3種酶活性從上至下、從EZ到MZ依次升高，木質(zhì)素含量從上至下、從EZ到MZ依次升高，說明16個在MZ中表達(dá)量顯著高于EZ的木質(zhì)素合成酶基因?qū)τ诿富钚云鸬搅苏{(diào)控作用，并且木質(zhì)素含量與酶活性呈正相關(guān)。同時(shí)，個別酶基因如PAL基因也受到了表達(dá)情況相反基因的調(diào)控，但是沒有影響到最終酶活性和木質(zhì)素含量結(jié)果，因此，基因的具體調(diào)控方式有待繼續(xù)深入研究。同時(shí)也表明了大豆主莖的木質(zhì)素含量調(diào)控的復(fù)雜機(jī)制。

木質(zhì)素酶基因表達(dá)影響木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性，進(jìn)而影響木質(zhì)素含量。PAL、CAD這2種酶活性與木質(zhì)素含量直接相關(guān)。降低了PAL活性后發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)木質(zhì)素含量和G型單體含量均降低，導(dǎo)致單體含量S/G值上升[31]；耿丹[32]通過對小麥中肉桂醇脫氫酶基因克隆及序列研究發(fā)現(xiàn)，CAD基因表達(dá)量增加，莖稈木質(zhì)素含量升高，小麥抗倒伏性隨之增強(qiáng)。因此PAL、CAD這2種酶活性對木質(zhì)素含量均為正向調(diào)控。

在本研究中僅設(shè)置了高密度與低密度2個處理，其最適密度下大豆莖稈中的木質(zhì)素含量和抗彎折能力與抗倒伏關(guān)系沒有呈現(xiàn)出來。但研究表明，低密度下的大豆莖稈中木質(zhì)素含量較高，抗倒伏能力較強(qiáng)，研究結(jié)果對大豆生產(chǎn)有指導(dǎo)意義。

本研究選用Charleston為研究材料，對木質(zhì)素積累方面進(jìn)行分析比較，得出以下結(jié)論：大豆植株中木質(zhì)素含量由植株上端到下端逐漸升高，低密度處理下大豆莖中木質(zhì)素含量高于高密度處理。無論是高密度還是低密度處理，大豆單一節(jié)間(莖3)木質(zhì)素含量均為MZ>EZ。低密度處理莖中PAL、CAD 2種酶活性高于高密度，酶活性和基因表達(dá)量對應(yīng)。