• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    棉花GaLMI1-like基因功能及其啟動子表達分析

    2022-07-11 08:05:58楊小貝陳二永李成偉
    華北農(nóng)學(xué)報 2022年3期
    關(guān)鍵詞:葉形同源擬南芥

    楊小貝,陳二永,李成偉

    (1.河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院,河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001)

    葉片是農(nóng)作物的重要器官,在光合產(chǎn)物的積累、氣體交換、養(yǎng)分分配和水分運輸中起著重要的作用[1]。葉片形狀會顯著影響植物的冠層蒸發(fā)散熱、日光和化學(xué)農(nóng)藥的滲透、害蟲的喜好以及作物的最終產(chǎn)量和質(zhì)量[2]。葉形的多樣性反映了自然選擇對葉片功能的篩選作用,不同葉形是了解其生態(tài)學(xué)、進化驅(qū)動力及其功能意義的寶貴資源[3]。通過改變作物葉形而創(chuàng)制出農(nóng)藝性狀優(yōu)良的作物新品種是農(nóng)作物育種需要關(guān)注的一個重要方向[4]。

    棉花是世界上重要的纖維作物和油料作物,棉纖維大量應(yīng)用于紡織工業(yè)。我國作為棉花生產(chǎn)大國,棉花及其紡織產(chǎn)品在我國國民經(jīng)濟中占有較大比例。棉花是喜光作物,在光照充足的條件下長勢較好,光照也是影響棉花植株生長發(fā)育和纖維品質(zhì)優(yōu)劣的重要條件之一[5]。葉片作為重要的光合器官,葉片形態(tài)在棉花品種之間存在顯著的表型差異,自然界的棉花擁有如鋸齒形、淺裂形、雞腳形、楓葉形等不同葉形。棉花葉形是影響其冠層結(jié)構(gòu)、產(chǎn)量、耐逆性和其他生產(chǎn)相關(guān)屬性的重要農(nóng)藝性狀[6]。

    現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),一些基因在葉形發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。SlLAX1可以平衡葉片近軸和遠軸細胞的生長,其突變可引起葉片卷曲表型[7]。ELI-A調(diào)控大麥葉舌的發(fā)育,ELI-A突變會引起葉鞘邊緣發(fā)育異常,產(chǎn)生無葉舌的葉片[8]。在擬南芥中過表達BRH1基因可改變?nèi)~型,降低葉片的長寬比[9]。AfLFY在煙草中過表達可以調(diào)控葉片發(fā)育,使其由圓形轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓形[10]。除了基因可調(diào)控葉片發(fā)育外,miRNA對葉片發(fā)育也有顯著影響,如miRNA160單突變體擬南芥在14 d時葉片為鋸齒狀,同樣大小的miRNA165/166突變體葉片為圓形[11]。KNOX1(Class IKNOTTED1-LIKEHOMEOBOX)調(diào)控著莖頂端分生組織 (SAM)的形成和維持。KNOX1功能的維持通過其在單葉植物和復(fù)葉植物的SAM及葉原基的表達模式差異實現(xiàn)[12]。另一個KNOX1基因SHOOTMERISTEMLESS對葉開裂的形成是十分必要的,在擬南芥中缺失該基因會形成不開裂葉片[13]。杯狀子葉基因CUC1、CUC2和CUC3參與胚胎頂端分生組織的形成和子葉邊界的特化[14]。CUC2對鋸齒狀葉的發(fā)育起始是必要的,而CUC3參與葉片鋸齒狀的維持[15]。進一步研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥中MIR164A與CUC2協(xié)同調(diào)控葉緣的鋸齒狀表型[16]。LMI1(LATEMERISTEMIDENTITY1)基因是擬南芥中形成簡單鋸齒狀葉片所必需的基因,而LMI1基因的缺失導(dǎo)致了苞片的形成[17]。在十字花科中有3種LMI1-like基因,它們的過表達可以改變擬南芥的葉形和產(chǎn)生深裂葉片[18]。BnA10.LMI1正向調(diào)控甘藍型油菜裂片葉的發(fā)育[19]。在棉花中,利用基因定位獲得一個LMI1同源基因,該基因同樣編碼一個HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子,被命名為GhLMI1-D1b,其是棉花葉片形狀變化的主要決定因素,將該基因沉默后可誘導(dǎo)葉片從雞腳葉向淺裂葉的轉(zhuǎn)變[20]。LMI1基因在種子植物中是保守的[21],其在葉形發(fā)育中的功能研究非常值得被關(guān)注,這些研究為培育理想葉形的農(nóng)作物新品種提供了堅實的理論基礎(chǔ)。

    LMI1基因是控制葉形發(fā)育的關(guān)鍵基因,但是其同源基因是否均具有調(diào)節(jié)葉形的功能,以及該基因及其同源基因如何被調(diào)控而造成自然界葉形多樣性的,目前依然知之甚少。植物形態(tài)多樣性通常是由發(fā)育基因的順式調(diào)節(jié)差異和相應(yīng)的時空表達來調(diào)控的[22-23]。順式調(diào)節(jié)的差異主要展現(xiàn)在啟動子的差異上,因此,研究LMI1同源基因的功能及分析LMI1同源基因的啟動子活性對理解LMI1同源基因調(diào)控植物葉形的機理具有十分重要的意義。

    本研究以具有雞腳葉表型的亞洲棉石溪亞1號為試驗材料,通過特異性引物克隆獲得GaLMI1-like基因序列和其啟動子序列,構(gòu)建GaLMI1-like基因過表達載體p6MYC-GaLMI1-like并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥,以驗證GaLMI1-like是否具有調(diào)控葉形發(fā)育的功能。同時,對GaLMI1-like基因啟動子序列進行順式作用元件分析,構(gòu)建GaLMI1-like啟動子GUS表達載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like并轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥,經(jīng)GUS染色分析GaLMI1-like啟動子驅(qū)動基因表達的模式,為理解GaLMI1-like基因及其啟動子在調(diào)控棉花葉形方面的功能機制和培育理想株型的棉花提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 植物材料 供試材料亞洲棉(Gossypiumarboretum)石溪亞1號、擬南芥 (Arabidopsisthaliana)哥倫比亞型 (Columbia-0,Col-0)均由河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心保存。

    1.1.2 菌株與載體 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101菌株購自上海唯地生物技術(shù)有限公司;克隆載體質(zhì)粒pMDTM19-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司;過表達載體質(zhì)粒p6MYC與啟動子GUS表達載體質(zhì)粒pCAMBIA1391均為河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心保存。

    1.1.3 酶和化學(xué)試劑 限制性內(nèi)切酶 QuickCutTMKpnⅠ、QuickCutTMSpeⅠ、QuickCutTMHind Ⅲ和QuickCutTMBamH Ⅰ、高保真酶PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase均購自寶生物工程(大連)有限公司;BM2000、BM2000+與BM5000+DNA Marker購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司;DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小量抽提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;GUS染色試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司;引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 棉花和擬南芥DNA的提取 取亞洲棉石溪亞1號三葉期葉片或者移栽后20 d左右的Col-0擬南芥葉片,放置于研缽中并經(jīng)液氮冷凍后用研磨棒磨成粉末,依據(jù)說明書使用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(百泰克生物技術(shù)有限公司,DP3112)進行DNA提取,用于后續(xù)GaLMI1-like基因啟動子(簡稱pGaLMI1-like)的擴增或轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株的鑒定。

    1.2.2 棉花和擬南芥RNA的提取及cDNA的合成 取亞洲棉石溪亞1號三葉期葉片或生長21 d的Col-0與GaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片,液氮冷凍后研磨成粉末,使用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司,DP441)提取上述組織的總RNA。RNA提取完成后立即使用PrimeScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa,RR047A)合成cDNA,用于GaLMI1-like基因的克隆或者檢測GaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥是否為陽性植株。

    1.2.3GaLMI1-like基因及GaLMI1-like啟動子的擴增 以擬南芥LMI1蛋白序列為參考,在棉花基因組網(wǎng)站COTTONGEN(https://www.cottongen.org/)中利用BlastP同源搜索其在亞洲棉中的同源基因,將與LMI1相似性最大的基因命名為GaLMI1-like。分別以在棉花基因組中檢索到的GaLMI1-like基因及GaLMI1-like啟動子序列為參考,利用 Primer Premier 6 軟件設(shè)計以下引物。GaLMI1-like基因過表達擴增引物為GaLMI1-like-F:5′-GGTACCTATGGATTGGAATGGCACCATT-3′,下劃線為酶切位點KpnⅠ;GaLMI1-like-R:5′-ACTAGTTTAGGGATAAGAAGGGAGTTG-3′,下劃線為酶切位點SpeⅠ。GaLMI1-like啟動子擴增引物序列為pGaLMI1-like-F:5′-AAGCTTACACTCTGCAATCTGCATGAA-3′,下劃線表示酶切位點Hind Ⅲ;pGaLMI1-like-R:5′-GGATCCTTTTCTTTGAATAAAGAAAGCGA-3′,下劃線表示酶切位點BamH Ⅰ。以從石溪亞1號棉花提取RNA后反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板PCR擴增GaLMI1-like基因,同時,以棉花石溪亞1號DNA為模板PCR擴增GaLMI1-like啟動子序列。擴增反應(yīng)體系(20 μL體系):PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase 0.2 μL;5×PrimeSTAR GXL Buffer 4 μL;cDNA/DNA 1 μL;GaLMI1-like-F/pGaLMI1-like-F(10 μmol/L)0.5 μL;GaLMI1-like-R/pGaLMI1-like-R(10 μmol/L)0.5 μL;2.5 mmol/L dNTPs 2 μL;ddH2O 11.8 μL。PCR反應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性30 s,56 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸45 s,30個循環(huán);72 ℃繼續(xù)延伸10 min,4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后將上述2種PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入新制的1.5%瓊脂糖凝膠中。使用電壓120 V、電流150 A進行瓊脂糖凝膠電泳,運行時長15 min;然后置于瓊脂糖凝膠成像儀中進行觀測,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的條帶進行切膠處理,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化目的片段,得到的目的片段進行加A反應(yīng)后連接到測序載體pMDTM19-T上,構(gòu)建pMDTM19-T-GaLMI1-like和pMDTM19-T-pGaLMI1-like,分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α并涂布含有氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB平板,待長出菌斑后挑取單克隆菌落進行PCR驗證,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測含有正確目的條帶的單菌落進行搖菌培養(yǎng),之后將菌液送至武漢金開瑞公司進行測序。

    1.2.4GaLMI1-like過表達載體及GaLMI1-like啟動子GUS表達載體的構(gòu)建 使用QuickCutTMKpnⅠ和QuickCutTMSpeⅠ酶切pMDTM19-T-GaLMI1-like重組載體,利用QuickCutTMHind Ⅲ和QuickCutTMBamH Ⅰ酶切pMDTM19-T-pGaLMI1-like重組載體,瓊脂糖凝膠分離并分別回收GaLMI1-like基因和GaLMI1-like啟動子片段。將GaLMI1-like基因與經(jīng)QuickCutTMKpnⅠ和QuickCutTMSpeⅠ酶切線性化的p6MYC進行連接反應(yīng),GaLMI1-like啟動子片段與經(jīng)QuickCutTMHind Ⅲ和QuickCutTMBamH Ⅰ線性化的pCAMBIA1391載體進行連接重組,之后分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α,然后進行菌落PCR鑒定,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的陽性菌落進行搖菌提取質(zhì)粒,再次用限制性內(nèi)切酶QuickCutTMKpnⅠ和QuickCutTMSpeⅠ、QuickCutTMHind Ⅲ和QuickCutTMBamH Ⅰ分別酶切鑒定重組載體p6MYC-GaLMI1-like和pCAMBIA1391-pGaLMI1-like,瓊脂糖凝膠電泳檢測出現(xiàn)大小正確的GaLMI1-like基因和GaLMI1-like啟動子片段后可確認成功得到GaLMI1-like過表達載體p6MYC-GaLMI1-like與GaLMI1-like啟動子GUS載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like。

    1.2.5GaLMI1-like啟動子序列分析 運用數(shù)據(jù)庫New PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對GaLMI1-like啟動子序列中包含的順式作用元件進行分析。

    1.2.6 擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定 p6MYC-GaLMI1-like和pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥T0植株的獲得采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法[24]。收取轉(zhuǎn)基因擬南芥T0種子,經(jīng)表面滅菌消毒后均勻地播種在含有潮霉素和頭孢霉素的MS篩選培養(yǎng)基上,大約12 d后將篩選獲得的根系較長且長出2片真葉的T1幼苗移栽至營養(yǎng)土中,置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了驗證p6MYC-GaLMI1-like是否成功轉(zhuǎn)化擬南芥Col-0,提取生長21 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片RNA并轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用半定量PCR法檢測GaLMI1-like基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中有無上調(diào)表達。半定量PCR使用的內(nèi)參基因為AtUBQ10(At4g05320),引物序列為AtUBQ10-F:5′-CAGAACTTTGGCCGACTAC-3′,AtUBQ10-R:5′-ATGGTCTTTCCGGTGAGAG-3′。同時,為了檢測是否獲得pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株,待轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在培養(yǎng)箱中生長30 d后,取葉片提取DNA,PCR鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株。PCR鑒定所使用的引物同載體構(gòu)建引物,即pGaLMI1-like-F與pGaLMI1-like-R。對PCR鑒定陽性的T1植株進行收種,之后將T1種子點播到含有潮霉素的MS培養(yǎng)基進行抗性篩選以獲得T2幼苗,培養(yǎng)方式同T1,直至收獲T2種子。擬南芥培養(yǎng)條件設(shè)置為光周期16 h光照/8 h黑暗、溫度22 ℃(光照)/19 ℃(黑暗)、光照強度12 000 lx、濕度55%[25]。

    1.2.7 GUS染色分析 取pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥種子、剛萌發(fā)的種子、萌發(fā)3 d和12 d的幼苗、生長30 d的莖生葉、花和角果等組織,依照說明書使用華越洋公司的GUS染色劑進行組織化學(xué)染色。脫色后的組織材料使用體視顯微鏡 (AXIO Zoom.V16,Zeiss)進行觀察并拍照記錄。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 GaLMI1-like蛋白結(jié)構(gòu)域及進化分析

    以擬南芥LMI1蛋白序列為參考,利用BlastP在棉花數(shù)據(jù)庫COTTONGEN(https://www.cottongen.org/)中同源搜索其在亞洲棉中的同源基因,將與LMI1同源性最大的同源基因(Cotton_A_00507_BGI-A2_v1.0)命名為GaLMI1-like。利用SMART網(wǎng)站預(yù)測GaLMI1-like蛋白的結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)其含有一個homeobox(HOX)結(jié)構(gòu)域(圖1-A)。含有HOX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)多為DNA結(jié)合因子,這類蛋白質(zhì)主要參與關(guān)鍵發(fā)育過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),這預(yù)示著GaLMI1-like蛋白在棉花生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。利用GaLMI1-like蛋白序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索其同源基因,獲得其在棉花和其他物種的12種同源基因,進一步利用MEGA 6軟件分析GaLMI1-like蛋白與其同源蛋白的進化關(guān)系(圖1-B),結(jié)果表明,GaLMI1-like與同物種陸地棉(Gossypiumhirsutum)中登錄號為KAG4215939.1的蛋白質(zhì)聚在一起,暗示陸地棉中登錄號為KAG4215939.1的蛋白質(zhì)基因起源于亞洲棉的GaLMI1-like基因。同時結(jié)果顯示,GaLMI1-like蛋白與異源物種木槿中登錄號為XP 039051516.1的蛋白質(zhì)進化關(guān)系較近,說明GaLMI1-like蛋白與登錄號為XP 039051516.1的蛋白質(zhì)具有相似的功能。

    A.GaLMI1-like蛋白結(jié)構(gòu)域分析;B.GaLMI1-like及其同源蛋白進化樹分析。A.The domain analysis of GaLMI1-like;B.Phylogenetic tree analysis of GaLMI1-like and its homologous proteins.

    2.2GaLMI1-like基因的克隆

    以從棉花基因組數(shù)據(jù)庫COTTONGEN(https://www.cottongen.org/)中獲取的GaLMI1-like基因序列為參考,設(shè)計可擴增其編碼區(qū)的特異性引物,以從亞洲棉石溪亞1號提取RNA轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板,PCR擴增GaLMI1-like基因,瓊脂糖凝膠電泳顯示,在681 bp左右有一條明亮條帶,與已知GaLMI1-like基因序列大小一致(圖2)。對瓊脂糖凝膠電泳顯示的明亮條帶進行膠回收,與pMDTM19-T載體連接獲得pMDTM19-T-GaLMI1-like重組載體,測序后與GaLMI1-like基因序列進行比對,結(jié)果顯示,其與GaLMI1-like基因序列一致,說明成功克隆了GaLMI1-like基因。

    M.DNA Marker;1,2.GaLMI1-like基因片段。M.DNA Marker;1,2.GaLMI1-like gene fragment.

    2.3 p6MYC-GaLMI1-like載體的構(gòu)建

    為了研究GaLMI1-like基因的功能,設(shè)計構(gòu)建GaLMI1-like的過表達載體。搖菌、提取質(zhì)粒后利用QuickCutTMKpnⅠ和QuickCutTMSpeⅠ對p6MYC-GaLMI1-like重組載體進行酶切鑒定,結(jié)果顯示,重組載體被切割為一條680 bp左右的條帶和一條大于5 000 bp的條帶(圖3),與預(yù)期的GaLMI1-like基因條帶和p6MYC載體條帶大小一致,說明已成功構(gòu)建GaLMI1-like基因的過表達載體p6MYC-GaLMI1-like,重組載體的結(jié)構(gòu)如圖4所示。通過凍融法將p6MYC-GaLMI1-like載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101,挑取單克隆進行菌落PCR 鑒定,選取鑒定正確的陽性菌株進行搖培,甘油保種放置于-80 ℃冰箱,以備轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0使用。

    M.DNA Marker;1—3.p6MYC-GaLMI1-like表達載體。M.DNA Marker;1—3.p6MYC-GaLMI1-like expression vector.

    圖4 植物表達載體p6MYC-GaLMI1-like的構(gòu)建示意圖Fig.4 The construction diagram of plant expression vector p6MYC-GaLMI1-like

    2.4GaLMI1-like基因功能分析

    為了驗證GaLMI1-like基因在植物生長發(fā)育中的功能,利用YEP液體搖培轉(zhuǎn)化有p6MYC-GaLMI1-like重組載體的農(nóng)桿菌GV3101,采用蘸花法轉(zhuǎn)化盛花期的擬南芥Col-0,收取轉(zhuǎn)基因T0種子,干燥7 d后將其播種于含有潮霉素和頭孢霉素的MS培養(yǎng)基上,篩選獲得T1幼苗,12 d后將其移栽于營養(yǎng)土中并置于光照培養(yǎng)箱中生長。為了驗證所篩選幼苗為陽性植株,提取21 d的擬南芥RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,半定量PCR法檢測GaLMI1-like基因在擬南芥中的表達情況,結(jié)果如圖5-A所示。在轉(zhuǎn)基因株系和野生型Col-0植株中內(nèi)參基因(AtUBQ10)表達量相對一致的情況下,野生型Col-0植株中并未檢測到GaLMI1-like基因的表達條帶,而3個轉(zhuǎn)基因植株均能檢測到GaLMI1-like基因的表達條帶,說明GaLMI1-like基因已經(jīng)在擬南芥中成功過表達。待生長30 d后,對3個GaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株進行表型觀察,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片出現(xiàn)多種不同的表型。如圖5-B所示,轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片表現(xiàn)出單一凹陷缺刻表型和不對稱發(fā)育表型;圖5-C顯示,轉(zhuǎn)基因擬南芥顯現(xiàn)出弱的對稱缺刻表型;而圖5-D中轉(zhuǎn)基因擬南芥顯現(xiàn)出強的對稱缺刻表型。這些結(jié)果說明,GaLMI1-like在葉片發(fā)育尤其是葉片的缺刻表型形成中具有重要作用。

    A.半定量鑒定GaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株;B—D.GaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株表型觀察。A.Identification of GaLMI1-like transgenic Arabidopsis by semi-quantitative PCR;B—D.The phenotypic analysis of GaLMI1-like transgenic Arabidopsis.

    2.5GaLMI1-like啟動子片段的克隆

    用已知的GaLMI1-like基因序列檢索棉花基因組,獲取該基因起始密碼子(ATG)上游1 439 bp的序列,設(shè)計該序列特異性引物,以亞洲棉石溪亞1號基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示,在1 500 bp左右出現(xiàn)一條清晰明亮的條帶,大小與預(yù)期一致(圖6)。對PCR擴增產(chǎn)物進行膠回收,連接到pMDTM19-T載體獲得重組質(zhì)粒pMDTM19-T-pGaLMI1-like,之后進行測序和序列比對,結(jié)果顯示,擴增獲得的DNA序列與從棉花基因組檢索得到的序列完全一致,表明已經(jīng)成功克隆出GaLMI1-like的啟動子序列。

    M.DNA Marker;1,2.GaLMI1-like啟動子片段。M.DNA Marker;1,2.GaLMI1-like promoter fragment.

    2.6GaLMI1-like啟動子順式作用元件分析

    通過啟動子在線分析工具New PLACE和PlantCARE對GaLMI1-like啟動子序列所包含的順式作用元件進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表1),該啟動子除包含基本啟動子元件CAAT-box和TATA-box[26]外,還包含光調(diào)節(jié)和光響應(yīng)元件INRNTPSADB、 G-Box、GT1-motif、部分光響應(yīng)模塊Box 4[27]、MYB結(jié)合位點參與光響應(yīng)元件MRE、晝夜節(jié)律控制元件Circadian、細胞周期調(diào)節(jié)元件MSA-like、細胞分裂素響應(yīng)元件ARR1AT以及葉肉特異表達相關(guān)原件CACTFTPPCA1、莖特異表達相關(guān)元件NODCON和根特異表達相關(guān)元件ROOTMOTIFTAPOX1。這些結(jié)果說明,該啟動子可能調(diào)控下游基因GaLMI1-like對光和晝夜節(jié)律的響應(yīng),調(diào)控其參與細胞周期和對細胞分裂素的響應(yīng),以及調(diào)控其在葉肉細胞、莖和根細胞中的特異表達。

    表1 棉花GaLMI1-like啟動子順式作用元件分析Tab.1 Analysis of cis-acting elements of GaLMI1-like promoter in cotton

    2.7 pCAMBIA1391-pGaLMI1-like載體的構(gòu)建

    經(jīng)菌落PCR鑒定后,搖菌提取質(zhì)粒進一步利用QuickCutTMBamH Ⅰ和QuickCutTMHind Ⅲ對pCAMBIA1391-pGaLMI1-like重組載體進行酶切鑒定,結(jié)果顯示,重組載體能夠切割出2個片段(圖7),一條1 439 bp的條帶為pGaLMI1-like片段,另一條較大的條帶為pCAMBIA1391載體片段,與預(yù)期結(jié)果一致,說明GaLMI1-like的啟動子GUS載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like已被成功構(gòu)建,重組載體結(jié)構(gòu)如圖8所示。通過凍融法將pCAMBIA1391-pGaLMI1-like載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101,挑取單克隆進行菌落PCR 鑒定,選取鑒定正確的陽性菌株進行搖培,甘油保種放置于-80 ℃冰箱,以備轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0使用。

    M.DNA Marker;1—3.pCAMBIA1391-pGaLMI1-like表達載體。M.DNA Marker;1—3.pCAMBIA1391-pGaLMI1-like expression vector.

    圖8 植物表達載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like的構(gòu)建示意圖Fig.8 The construction diagram of plant expression vector pCAMBIA1391-pGaLMI1-like

    2.8 pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定

    為了獲得利用GaLMI1-like啟動子驅(qū)動GUS的過表達擬南芥植株,利用蘸花法將pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉(zhuǎn)化盛花期的野生型擬南芥Col-0,成熟后收取T0種子。用含有潮霉素和頭孢霉素的MS培養(yǎng)基對T0種子進行篩選,對篩選獲得的根系較長且長出真葉的T1幼苗進行移栽培養(yǎng),30 d后取T1幼苗的葉片進行DNA提取并進行PCR檢測,結(jié)果如圖9所示,轉(zhuǎn)基因陽性植株均能擴增出1 439 bp大小的條帶,而野生型對照Col-0未擴增出該目標(biāo)條帶。將T1陽性植株繼續(xù)培養(yǎng)并收獲T1種子;利用含有潮霉素的MS培養(yǎng)基對T1種子繼續(xù)篩選,獲得T2幼苗并培養(yǎng)收獲T2種子,為后續(xù)GUS染色分析提供試驗材料。

    M.DNA Marker;Col-0.野生型擬南芥(陰性對照);1—5.轉(zhuǎn)基因擬南芥。M.DNA Marker;Col-0.Wild Arabidopsis (Negative control);1—5.Transgenic Arabidopsis.

    2.9GaLMI1-like啟動子功能分析

    為了分析GaLMI1-like基因的啟動子功能,對pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉(zhuǎn)基因陽性擬南芥T2種子、剛萌發(fā)的種子、3 d的幼苗、12 d的幼苗、莖生葉、花和角果等器官采用GUS染色劑進行組織化學(xué)染色,結(jié)果顯示,GUS主要在子葉、真葉(蓮座葉)、莖生葉、莖和根的中柱中表達,而在花、角果和成熟種子中未見表達(圖10)。這說明GaLMI1-like基因的啟動子可驅(qū)動下游基因在子葉、真葉、莖生葉、莖和根的中柱中表達,其中主要在葉片中表達。

    A.種子;B.剛萌發(fā)的種子;C.3 d的幼苗;D.12 d的幼苗;E、F.莖生葉;G.花;H.角果。A.Seed;B.Budding seed;C.Three days old seedling;D.Twelve days old seedling;E,F(xiàn).Stem leaf;G.Flower;H.Silique.

    3 討論與結(jié)論

    在植物界,葉片的類型具有廣泛的多態(tài)性,這引起了科研人員的濃厚興趣和對其背后調(diào)控機制的廣泛研究。在分子水平上,已發(fā)現(xiàn)諸多基因參與葉片的生長發(fā)育[12-14,16-17],其中LMI1及其同源基因在葉形中的功能不容忽視[17-20]。在棉花中,通過定位發(fā)現(xiàn),GhLMI1-D1b主要調(diào)控陸地棉中雞腳葉的形成,而陸地棉作為四倍體植物(2n=4x=52,AADD)是由二倍體A基因組棉花(2n=2x=26,AA)和二倍體D基因組棉花(2n=2x=26,DD)進化而來的[28-29]。為解析陸地棉中來自D基因組的GhLMI1-D1b控制雞腳葉形成的原因,及陸地棉中A基因組上的GhLMI1-A能否調(diào)控雞腳葉的發(fā)育,用擬南芥LMI1序列同源比對亞洲棉基因組,將與其相似性最大的基因命名為GaLMI1-like,之后進行功能分析。GaLMI1-like蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),其含有homeobox(HOX)結(jié)構(gòu)域,這與對GhLMI1-D1b蛋白結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果是一致的。進化分析發(fā)現(xiàn),GaLMI1-like與陸地棉中登錄號為KAG4215939.1的蛋白質(zhì)聚集在一起,而與D基因組棉花雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)中登錄號為XP012469169.1的蛋白質(zhì)并未完全聚集在一起。說明陸地棉中登錄號為KAG4215939.1的蛋白質(zhì)起源于A基因組亞洲棉的GaLMI1-like,同時A基因組的GaLMI1-like與D基因組的同源蛋白(登錄號為XP012469169.1)在功能上應(yīng)該具有差異性。本試驗為了研究GaLMI1-like是否具有調(diào)控葉形發(fā)育的功能,以具有雞腳葉表型的A基因組棉花亞洲棉石溪亞1號為材料,克隆了GaLMI1-like基因,并構(gòu)建了GaLMI1-like基因的過表達載體p6MYC-GaLMI1-like,通過蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,然后通過篩選獲得陽性植株,表型觀察發(fā)現(xiàn),與對照Col-0相比,GaLMI1-like轉(zhuǎn)基因過表達擬南芥葉片具有不對稱發(fā)育表型、凹陷單一缺刻表型和對稱缺刻表型,這些結(jié)果說明,A基因組棉花中的GaLMI1-like基因可以調(diào)控棉花葉片發(fā)育及缺刻表型的產(chǎn)生。但是,在四倍體陸地棉中雞腳葉表型主要是由D基因組的GhLMI1-D1b調(diào)控[20],這有可能是A基因組起源的GaLMI1-like基因被抑制了表達,其中的機制還需進一步研究。

    研究發(fā)現(xiàn),BnA10.LMI1上游啟動子調(diào)控區(qū)域的變異造成其表達量的上升,進而引起甘藍型油菜淺裂葉片的形成[19]。RCO(REDUCEDCOMPLEXITY)也是一個LMI1的同源基因,其增強子序列的改變引起了RCO基因表達的差異,從而調(diào)控植物產(chǎn)生不同的葉形[21]。在棉花中,GhLMI1-D1b啟動子中增加的一個串聯(lián)重復(fù)序列引起該基因表達量的上調(diào),這也是形成雞腳葉表型的重要原因[20]。綜上所述,啟動子及其他調(diào)控序列所調(diào)控的基因表達差異是控制葉形的關(guān)鍵因素。因此,本研究以亞洲棉石溪亞1號為材料,克隆了棉花中LMI1同源基因GaLMI1-like的啟動子序列,通過分析發(fā)現(xiàn),該啟動子序列具有多個TATA-box和CAAT-box等啟動子核心元件,說明其具有典型啟動子的特征。GaLMI1-like啟動子序列除具有典型的啟動子核心元件外,還包含許多與基因功能相關(guān)的調(diào)節(jié)元件,其中有光響應(yīng)元件G-Box、GT1-motif、INRNTPSADB,晝夜節(jié)律調(diào)控元件Circadian,莖特異表達元件NODCON,根特異表達元件ROOTMOTIFTAPOX1,部分光響應(yīng)模塊Box 4[27],MYB結(jié)合位點參與光響應(yīng)元件MRE。LMI1及其同源基因的主要功能是調(diào)控葉片發(fā)育形成不同葉形[17-20],本研究也在GaLMI1-like啟動子序列中發(fā)現(xiàn)許多發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)元件,如細胞周期調(diào)節(jié)元件MSA-like、細胞分裂素響應(yīng)元件ARR1AT、葉肉特異表達元件CACTFTPPCA1,這些結(jié)果暗示,GaLMI1-like啟動子調(diào)控GaLMI1-like的時空表達進而調(diào)控棉花的葉形。進一步將GaLMI1-like啟動子連接到GUS報告基因載體pCAMBIA1391獲得重組表達載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like,轉(zhuǎn)化擬南芥并篩選獲得T2材料。組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,GaLMI1-like啟動子主要驅(qū)動GUS報告基因在子葉、真葉(蓮座葉)、莖生葉、莖和根的中柱中表達,而在花、角果和成熟種子中未見表達。這些結(jié)果與對GaLMI1-like啟動子基因功能相關(guān)的調(diào)節(jié)元件分析結(jié)果是一致的。在組織化學(xué)染色結(jié)果中發(fā)現(xiàn),子葉、真葉(蓮座葉)和莖生葉中GUS染色較深,其他能夠染色的部位較淺,這與之前報道LMI1及其同源基因主要控制葉形發(fā)育的研究結(jié)果[17-20]是一致的。LMI1主要在葉片的邊緣表達,尤其是在鋸齒狀部位表達量較高[17];LMI1的同源基因RCO主要在碎米芥的2個小葉之間的凹陷處表達[21],這與本研究發(fā)現(xiàn)的GaLMI1-like啟動子驅(qū)動GUS基因幾乎在整片葉子中表達不同。說明同源基因在表達模式上存在種屬差異性,所以需要對具體物種中LMI1基因的調(diào)控機制進行有針對性的研究。

    綜上所述,利用PCR技術(shù)克隆了A基因組棉花亞洲棉石溪亞1號的GaLMI1-like基因及其啟動子序列,分析了GaLMI1-like蛋白的結(jié)構(gòu)域和進化關(guān)系,并構(gòu)建了GaLMI1-like基因的過表達載體p6MYC-GaLMI1-like,通過轉(zhuǎn)化擬南芥證實了GaLMI1-like基因具有調(diào)控葉片缺刻表型發(fā)育的功能。同時,通過在線軟件分析了該基因啟動子的順式作用元件,構(gòu)建了GaLMI1-like啟動子與GUS報告基因融合的植物表達載體并轉(zhuǎn)化了模式植物擬南芥,通過GUS染色分析了GaLMI1-like基因的組織表達模式,結(jié)果顯示,GaLMI1-like啟動子可驅(qū)動下游基因在根、莖、葉中表達,且主要在葉中表達。本研究結(jié)果為進一步揭示GaLMI1-like調(diào)控棉花葉形發(fā)育的機理和利用GaLMI1-like培育理想葉型的棉花新品系奠定了基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    葉形同源擬南芥
    藥食同源
    ——紫 蘇
    兩岸年味連根同源
    華人時刊(2023年1期)2023-03-14 06:43:36
    擬南芥:活得粗糙,才讓我有了上太空的資格
    以同源詞看《詩經(jīng)》的訓(xùn)釋三則
    尿黑酸對擬南芥酪氨酸降解缺陷突變體sscd1的影響
    兩種LED光源作為擬南芥生長光源的應(yīng)用探究
    擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應(yīng)機制探究
    虔誠書畫乃同源
    楓葉
    水稻葉形遺傳調(diào)控機理的研究進展
    大香蕉久久网| 亚洲国产精品成人综合色| 国产真实伦视频高清在线观看| kizo精华| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲国产色片| 欧美一区二区亚洲| 精品久久久久久电影网| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日韩成人伦理影院| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久久精品欧美日韩精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 最近的中文字幕免费完整| 欧美国产精品一级二级三级 | 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 成年免费大片在线观看| 久久久久九九精品影院| 精品少妇久久久久久888优播| 国产av不卡久久| 99热网站在线观看| 免费观看a级毛片全部| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久久久国产网址| av在线app专区| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日韩中字成人| 国产精品一区二区性色av| 成年女人看的毛片在线观看| 熟女av电影| 又爽又黄无遮挡网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 国产男女内射视频| 欧美日韩视频精品一区| 国产高清不卡午夜福利| 男女无遮挡免费网站观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 色视频在线一区二区三区| 亚洲精品色激情综合| av免费在线看不卡| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 永久网站在线| 国产高清不卡午夜福利| 国产探花极品一区二区| 男人添女人高潮全过程视频| 又爽又黄a免费视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久久久网色| 97热精品久久久久久| 久久影院123| 国产一区亚洲一区在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 草草在线视频免费看| 国产精品福利在线免费观看| 久久精品人妻少妇| 国产精品久久久久久久电影| 99视频精品全部免费 在线| 欧美人与善性xxx| 欧美日本视频| 久久久精品免费免费高清| 国产精品蜜桃在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日日摸夜夜添夜夜爱| av免费观看日本| 夫妻性生交免费视频一级片| av黄色大香蕉| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲av免费高清在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 天天躁日日操中文字幕| 午夜福利视频精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 久久久精品94久久精品| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美日韩在线观看h| 边亲边吃奶的免费视频| av在线亚洲专区| 国产在线一区二区三区精| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 精品国产三级普通话版| 精品国产三级普通话版| 日日撸夜夜添| 丰满人妻一区二区三区视频av| 97超视频在线观看视频| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲最大成人av| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产乱人视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日韩人妻高清精品专区| 黄片无遮挡物在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 日日啪夜夜撸| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久久a久久爽久久v久久| 少妇熟女欧美另类| 国模一区二区三区四区视频| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲四区av| 亚洲精品日本国产第一区| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 香蕉精品网在线| 干丝袜人妻中文字幕| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 性色avwww在线观看| 婷婷色综合www| 一区二区三区乱码不卡18| 男插女下体视频免费在线播放| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 丝袜脚勾引网站| 一级av片app| 日本黄色片子视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 精品久久久久久久末码| 久久6这里有精品| 国产男人的电影天堂91| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产精品偷伦视频观看了| 久久国产乱子免费精品| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲欧洲国产日韩| 99热国产这里只有精品6| 日韩中字成人| 久久久成人免费电影| 亚洲内射少妇av| 日本av手机在线免费观看| 精品少妇久久久久久888优播| 综合色丁香网| 天美传媒精品一区二区| 舔av片在线| 久久久精品欧美日韩精品| 舔av片在线| 青青草视频在线视频观看| 成人特级av手机在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 精品一区在线观看国产| 国产视频首页在线观看| 中国国产av一级| 国产亚洲最大av| 午夜免费鲁丝| 日本av手机在线免费观看| 嫩草影院新地址| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产在视频线精品| 好男人在线观看高清免费视频| 嘟嘟电影网在线观看| 99久久人妻综合| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品.久久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 男男h啪啪无遮挡| 嫩草影院入口| 丝袜脚勾引网站| 18禁动态无遮挡网站| 日日啪夜夜爽| 99久久精品一区二区三区| 人妻一区二区av| 99久久九九国产精品国产免费| av福利片在线观看| av网站免费在线观看视频| 亚洲精品,欧美精品| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩中字成人| 2018国产大陆天天弄谢| 69av精品久久久久久| 男插女下体视频免费在线播放| 免费黄色在线免费观看| 日本三级黄在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美潮喷喷水| 国产永久视频网站| 国产亚洲5aaaaa淫片| 免费电影在线观看免费观看| 欧美另类一区| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 日韩人妻高清精品专区| 精品国产乱码久久久久久小说| 一本色道久久久久久精品综合| 青春草亚洲视频在线观看| 久久97久久精品| 下体分泌物呈黄色| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久精品免费免费高清| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 男人狂女人下面高潮的视频| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲人成网站在线播| 国产色爽女视频免费观看| 可以在线观看毛片的网站| 国产成人freesex在线| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久国产乱子免费精品| 色吧在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 日韩亚洲欧美综合| 欧美成人精品欧美一级黄| 男女那种视频在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲天堂av无毛| 午夜激情久久久久久久| 色视频在线一区二区三区| 免费黄色在线免费观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲国产精品999| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产黄频视频在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 观看美女的网站| 国产成人aa在线观看| 99热6这里只有精品| 免费看av在线观看网站| 直男gayav资源| 天堂网av新在线| 日本熟妇午夜| 天堂中文最新版在线下载 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 一二三四中文在线观看免费高清| 一区二区三区免费毛片| 亚洲人与动物交配视频| 大片免费播放器 马上看| 777米奇影视久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 午夜福利视频精品| 国产片特级美女逼逼视频| 一级黄片播放器| 久久久a久久爽久久v久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久精品国产亚洲av涩爱| 欧美区成人在线视频| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲怡红院男人天堂| 69av精品久久久久久| 三级国产精品片| 精品久久久噜噜| 成人免费观看视频高清| 日本与韩国留学比较| 2018国产大陆天天弄谢| 大香蕉97超碰在线| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 在现免费观看毛片| 美女视频免费永久观看网站| 一级毛片aaaaaa免费看小| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲欧美精品专区久久| 国产男女内射视频| 精品久久久久久久末码| 久久精品久久久久久久性| 国产成人一区二区在线| 永久免费av网站大全| 国产成人91sexporn| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久久精品免费免费高清| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲av一区综合| 国产人妻一区二区三区在| 国产精品久久久久久久久免| 秋霞伦理黄片| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲成人中文字幕在线播放| av又黄又爽大尺度在线免费看| 青青草视频在线视频观看| 精品久久久精品久久久| 久久久a久久爽久久v久久| 特级一级黄色大片| 男人舔奶头视频| 久久久久久久午夜电影| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 午夜免费男女啪啪视频观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 2018国产大陆天天弄谢| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲国产精品国产精品| 插逼视频在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 搡老乐熟女国产| 亚洲精品日本国产第一区| 九九爱精品视频在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| freevideosex欧美| 国产成人91sexporn| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲国产精品成人综合色| 成人无遮挡网站| 欧美丝袜亚洲另类| 超碰97精品在线观看| 精品一区二区三卡| 天天一区二区日本电影三级| 熟女电影av网| 亚洲天堂av无毛| 亚洲内射少妇av| 免费观看无遮挡的男女| 大香蕉97超碰在线| 晚上一个人看的免费电影| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美激情久久久久久爽电影| 只有这里有精品99| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产乱人偷精品视频| 黄色日韩在线| 亚洲美女视频黄频| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 99久久九九国产精品国产免费| 免费观看a级毛片全部| 69人妻影院| 久久精品国产亚洲av天美| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲av男天堂| 国模一区二区三区四区视频| 如何舔出高潮| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美bdsm另类| 日韩欧美精品免费久久| 熟妇人妻不卡中文字幕| 夫妻性生交免费视频一级片| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久久精品性色| 秋霞伦理黄片| 日日啪夜夜撸| 国产成人a∨麻豆精品| 国产日韩欧美在线精品| 国产免费一级a男人的天堂| 我的女老师完整版在线观看| 好男人视频免费观看在线| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 精品久久久久久久久av| 国产乱来视频区| 熟女电影av网| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久久久性生活片| 在线精品无人区一区二区三 | 国产女主播在线喷水免费视频网站| 丰满人妻一区二区三区视频av| 热99国产精品久久久久久7| 午夜精品一区二区三区免费看| 午夜日本视频在线| 国产成人a∨麻豆精品| 成人美女网站在线观看视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 18禁动态无遮挡网站| 国产老妇女一区| 成人国产av品久久久| 内射极品少妇av片p| 草草在线视频免费看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 大陆偷拍与自拍| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 色吧在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品人妻久久久影院| 观看免费一级毛片| 午夜激情久久久久久久| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美性感艳星| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲久久久久久中文字幕| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 亚州av有码| 欧美一级a爱片免费观看看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国产大屁股一区二区在线视频| 我的女老师完整版在线观看| tube8黄色片| 亚洲精品乱久久久久久| 秋霞伦理黄片| 深爱激情五月婷婷| 国产成人精品福利久久| 能在线免费看毛片的网站| 全区人妻精品视频| 丝袜脚勾引网站| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲精品第二区| 国产极品天堂在线| 嘟嘟电影网在线观看| 少妇丰满av| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲国产欧美在线一区| 人人妻人人看人人澡| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲性久久影院| 久久久久久久精品精品| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| av网站免费在线观看视频| 99热6这里只有精品| 亚洲自拍偷在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲丝袜综合中文字幕| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 内射极品少妇av片p| 国产成人免费无遮挡视频| 看十八女毛片水多多多| 亚洲欧美清纯卡通| 国产乱人视频| 亚洲精品456在线播放app| 成人国产麻豆网| 国产综合懂色| 亚洲内射少妇av| 秋霞伦理黄片| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲不卡免费看| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 美女高潮的动态| 精品人妻偷拍中文字幕| 午夜老司机福利剧场| 在线精品无人区一区二区三 | 视频中文字幕在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| xxx大片免费视频| 97在线人人人人妻| 日韩中字成人| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲av中文av极速乱| 好男人在线观看高清免费视频| 国产老妇女一区| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲欧美日韩东京热| 嫩草影院精品99| a级一级毛片免费在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 涩涩av久久男人的天堂| 国产精品偷伦视频观看了| 国产美女午夜福利| 大陆偷拍与自拍| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久久精品免费免费高清| 精品久久久久久电影网| 干丝袜人妻中文字幕| 91久久精品电影网| 一区二区三区四区激情视频| 国产毛片在线视频| 2018国产大陆天天弄谢| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久久影院123| 免费观看无遮挡的男女| 91精品一卡2卡3卡4卡| 久久人人爽人人爽人人片va| 香蕉精品网在线| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲色图综合在线观看| 联通29元200g的流量卡| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美最新免费一区二区三区| 激情 狠狠 欧美| tube8黄色片| eeuss影院久久| 日本黄色片子视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 日本欧美国产在线视频| 一个人看的www免费观看视频| 超碰av人人做人人爽久久| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 简卡轻食公司| 国产熟女欧美一区二区| 深爱激情五月婷婷| 国产成人a区在线观看| eeuss影院久久| 少妇 在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 日本免费在线观看一区| 午夜免费鲁丝| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产成人aa在线观看| 免费av不卡在线播放| 久久ye,这里只有精品| 精品一区二区三卡| 日本色播在线视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日韩国内少妇激情av| 国产黄a三级三级三级人| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产av码专区亚洲av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 三级经典国产精品| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 高清av免费在线| 伊人久久国产一区二区| 精品人妻视频免费看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 九九在线视频观看精品| 69av精品久久久久久| 久久久久国产网址| 偷拍熟女少妇极品色| 18+在线观看网站| 国产成人精品婷婷| 国产 一区 欧美 日韩| 在线观看一区二区三区| 国产亚洲一区二区精品| 男女啪啪激烈高潮av片| 热99国产精品久久久久久7| 免费av不卡在线播放| 观看美女的网站| 内射极品少妇av片p| 在线观看国产h片| 赤兔流量卡办理| 大片电影免费在线观看免费| 高清在线视频一区二区三区| 最新中文字幕久久久久| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩一本色道免费dvd| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 97热精品久久久久久| 人妻一区二区av| av一本久久久久| 亚洲丝袜综合中文字幕| 免费av毛片视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲国产av新网站| 99热这里只有精品一区| av国产免费在线观看| 国产69精品久久久久777片| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 欧美三级亚洲精品| 日韩欧美精品免费久久| 黄色日韩在线| 一个人观看的视频www高清免费观看| 大香蕉久久网| 丝袜美腿在线中文| 天天一区二区日本电影三级| 国产精品女同一区二区软件| 国产毛片在线视频| 国产av国产精品国产| .国产精品久久| 97热精品久久久久久| 国产高清不卡午夜福利| 性色avwww在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 免费看日本二区| 亚洲精品成人久久久久久| 国产一级毛片在线| 久久久午夜欧美精品| 最近的中文字幕免费完整| 交换朋友夫妻互换小说| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲av中文av极速乱| 久久久久国产精品人妻一区二区| 三级国产精品欧美在线观看| 99久国产av精品国产电影| 国内精品美女久久久久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品熟女少妇av免费看| 毛片女人毛片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久久久网色| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 51国产日韩欧美| 男人舔奶头视频| 久久99热6这里只有精品| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲精品第二区| 国产黄色免费在线视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲av成人精品一二三区| 伊人久久国产一区二区| 亚州av有码| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲自偷自拍三级| 男女无遮挡免费网站观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久久久久久亚洲中文字幕| 777米奇影视久久| 午夜免费男女啪啪视频观看| 偷拍熟女少妇极品色| 99re6热这里在线精品视频| 一区二区三区四区激情视频| 色综合色国产| 美女内射精品一级片tv| 色网站视频免费| 男人和女人高潮做爰伦理| 寂寞人妻少妇视频99o|