成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3的表達(dá)預(yù)測(cè)膀胱癌預(yù)后

黃玉清，張 良，周海濱，李丹丹 (九江學(xué)院附屬醫(yī)院，江西 九江 332000)

膀胱癌作為臨床常見泌尿科常見惡性腫瘤之一，在全世界癌癥發(fā)病率排名中占據(jù)前十，且男性發(fā)病率顯著高于女性，50～70歲是患者病癥高發(fā)階段。雖然當(dāng)前針對(duì)膀胱癌治療方法存在多元化，但仍有報(bào)道指出，50%～70%的表淺性膀胱癌存在高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，10%～20%患者會(huì)發(fā)展成浸潤(rùn)性膀胱癌，嚴(yán)重者可能誘發(fā)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，縮短患者生存時(shí)間，降低其5年內(nèi)生存率[1]。

當(dāng)前，臨床針對(duì)膀胱癌患者除去手術(shù)切除病灶，還主張配合全身化療來(lái)提高其治療效果，藥物首選他濱、順鉑，均有一定確切療效。但大量研究證實(shí)，患者化療后的平均生存期只有15個(gè)月，5年內(nèi)生存率未超過(guò)20%，病死率也未得到顯著降低。與此同時(shí)，病灶根除術(shù)式優(yōu)化方向尚未明朗，臨床研究指出膀胱腫瘤發(fā)病與多條信號(hào)通路存在關(guān)聯(lián)，尤其是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(FGFR3)，在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中占據(jù)重要地位，因此臨床表明可借此為方向來(lái)研發(fā)新型靶點(diǎn)治療藥物[2]?；诖耍狙芯窟x擇2017年4月～2021年4月收治的膀胱癌患者80例，對(duì)其腫瘤組織進(jìn)行FGFR3基因突變和蛋白表達(dá)檢測(cè)，評(píng)估此類因子表達(dá)對(duì)膀胱癌預(yù)后關(guān)系的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料：本次研究均醫(yī)院倫理會(huì)審批，將2017年4月～2021年4月收治的膀胱癌80例為觀察對(duì)象，術(shù)后均配合病理檢查，并經(jīng)病理科主任醫(yī)生多次閱片確診，符合移性細(xì)胞癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)對(duì)本次研究保有知情同意權(quán)。所選患者中，男女所占比例為60∶20；年齡35～85歲，平均年齡(64.11±10.34)歲；病癥類型：低級(jí)別尿路上皮癌46例，高級(jí)別尿路上皮癌34例；手術(shù)類型：55例患者行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)，25例患者行根治性膀胱切除術(shù)+尿流改道術(shù)+術(shù)后GC化療(吉西他濱+順鉑)。將癌組織標(biāo)本置于10%甲醛溶液固定24 h后，選擇5 μm厚蠟塊對(duì)組織進(jìn)行連續(xù)切片，其中1片行蘇木精-伊紅染色，1片行FGFR3免疫組化染色，1片與PBS液反應(yīng)做成一抗空白對(duì)照。FGFR3單克隆抗體及免疫組化試劑盒分別于英國(guó)Abeam公司中國(guó)分公司、北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司購(gòu)買，操作步驟參照相關(guān)說(shuō)明書，F(xiàn)GFR3-抗視為工作液，以1∶20的比例將濃度稀釋后，有序完成色、復(fù)染、脫水和透明后封片等步驟。

1.2突變檢測(cè)：檢測(cè)所需組織是經(jīng)包埋石蠟組織塊中切取，選擇于Omega Bio-Tec公司購(gòu)買的試劑盒，完成組織DNA的分離和提取，后配合定量分析法對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，直至檢測(cè)樣本質(zhì)量達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。模板設(shè)計(jì)引物采取FGFR3基因熱點(diǎn)突變外顯子7、10和15，DNA行PCR擴(kuò)增。20 μl的PCR擴(kuò)增體系包括腫瘤DNA(1 μl)、Taq高保真酶(0.15 μl)、引物(0.8 μl)、dNTP(0.8 μl)、Mg2+(0.8 ml)、ddH2O(14.45 μl)、10×buffer(2 μl)。反應(yīng)條件包括外顯子在15～95 ℃溫度下的預(yù)變性(用時(shí)7 min)，94℃的變性(用時(shí)1 min),62℃退火(用時(shí)1.5 min)；外顯子7和10需在61 ℃溫度下退火(用時(shí)1.5 min)，后調(diào)整溫度至72 ℃，延長(zhǎng)1 min反應(yīng)時(shí)間，經(jīng)40個(gè)循環(huán)后在72℃環(huán)境下延長(zhǎng)7 min反應(yīng)時(shí)間。對(duì)擴(kuò)增后所得產(chǎn)物經(jīng)電泳分離來(lái)提高產(chǎn)物純度，后經(jīng)Sanger測(cè)序法得出產(chǎn)物結(jié)構(gòu)序列，應(yīng)用Chromas pro2.1.3軟件來(lái)判讀基因突變數(shù)值。

1.3評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：FGFR3蛋白表主要以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)為參考值，經(jīng)高倍鏡(×400)下，從5個(gè)不同視野來(lái)觀察所有患者腫瘤組織的免疫組化切片，其中，腫瘤細(xì)胞中著色呈黃色或棕黃色，視為陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)著色視為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1患者FGFR3基因突變、蛋白表達(dá)與各項(xiàng)參數(shù)值的相關(guān)性：FGFR3基因突變率、蛋白表達(dá)率分別為18.75%(15/80)、27.50%(22/80)，F(xiàn)GFR3蛋白表達(dá)與臨床各參數(shù)無(wú)較大關(guān)聯(lián)(P>0.05)；FGFR3基因突變與年齡、吸煙史、病理分期、腫瘤大小、復(fù)發(fā)情況等參數(shù)指標(biāo)存在相關(guān)性(P<0.05)。見表1。

表1 FGFR3基因突變、蛋白表達(dá)與各項(xiàng)參數(shù)值相關(guān)性[n(%)]

2.2FGFR3基因突變和蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性：FGFR3基因突變和蛋白表達(dá)一致性為33.33%(5/15)，但二者沒有關(guān)聯(lián)(P>0.05)，見表2。

表2 FGFR3基因突變和蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性(n)

2.3FGFF3基因突變和蛋白表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響：FGFR3基因突變和野生型的總生存期(OS)分別為(30.44±1.33)個(gè)月、(26.33±2.45)個(gè)月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；FGFR3蛋白表達(dá)陽(yáng)性、陰性分別是(27.89±1.33)個(gè)月、(27.33±1.63)個(gè)月，兩組數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；FGFR3基因突變和野生型的無(wú)瘤生存期(DFS)分別為(29.44±1.56)個(gè)月、(38.23±2.69)個(gè)月，前者DFS顯著低于后者(P<0.05)；FGFR3蛋白表達(dá)陽(yáng)性、陰性分別是(30.11±1.21)個(gè)月、(32.35±1.44)個(gè)月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此可見，F(xiàn)GFR3基因突變和蛋白表達(dá)與患者總生存期OS無(wú)聯(lián)系，F(xiàn)GFR3 蛋白表達(dá)對(duì)DFS不會(huì)造成影響，但FGFR3基因突變型膀胱癌與患者DFS有直接聯(lián)系。

3 討論

膀胱癌作為全球常見惡性腫瘤疾病，早期落實(shí)預(yù)防和診療工作，是提高患者生存率的關(guān)鍵。因此，尋找能科學(xué)評(píng)估膀胱癌復(fù)發(fā)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，為患者治療提供科學(xué)依據(jù)?；诖?，本次研究結(jié)果顯示FGFR3基因突變與年齡、吸煙史、病理分期、腫瘤大小、復(fù)發(fā)情況等參數(shù)指標(biāo)存在相關(guān)性，且FGFR3基因突變型膀胱癌的DFS較野生型低，可見FGFR3基因突變與患者預(yù)后存在直接影響；分析FGFR3基因突變和蛋白表達(dá)可見二者沒有關(guān)聯(lián)，且對(duì)OS無(wú)影響，蛋白表達(dá)與DFS沒有關(guān)聯(lián)。綜合上述結(jié)果分析，可見高齡男性患者FGFR3基因突變風(fēng)險(xiǎn)較高，存在吸煙史患者更甚，應(yīng)倡導(dǎo)全民戒煙來(lái)控制惡性腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。與此同時(shí)，F(xiàn)GFR3基因突變與患者術(shù)后腫瘤高復(fù)發(fā)存在明顯關(guān)聯(lián)，究其原因，分析可能是受其突變體激活下游的信號(hào)通路影響，加上此類突變會(huì)對(duì)機(jī)體急性炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)進(jìn)行抑制，促進(jìn)腫瘤發(fā)展或誘導(dǎo)病發(fā)。因此，臨床針對(duì)膀胱癌患者FGFR3基因突變現(xiàn)象，建議采取卡介苗膀胱灌注作首選方案，有利于控制腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[4]。當(dāng)前，臨床仍需加大關(guān)于腫瘤分子特性定義的相關(guān)研究，尋找能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)病灶生物學(xué)的相關(guān)標(biāo)志物，為提高靶向治療效果、延長(zhǎng)患者生存時(shí)間提供參考數(shù)據(jù)。

綜上所述，F(xiàn)GFR3基因表達(dá)用于膀胱癌預(yù)后評(píng)估中有一定應(yīng)用價(jià)值，但臨床仍需加大樣本研究證實(shí)其預(yù)測(cè)價(jià)值，僅供參考。