植物覆蓋對蕉園土壤微生物群落功能多樣性的影響

魏加弟，王永芬，何 翔，楊佩文，俞艷春，鄭泗軍,4，徐勝濤

（1云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明650205；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；3云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟作物研究所，云南 保山 678000；4國際生物多樣性中心，昆明 650205）

0 引言

中國的香蕉主產(chǎn)區(qū)主要分布在廣東、海南、福建、云南、廣西、臺灣六省[1]，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效的重要產(chǎn)業(yè)[2]。近年來，由于地表裸露造成蕉園土壤退化問題阻礙了中國香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展，如土壤板結(jié)、養(yǎng)分流失和微生物群落結(jié)構(gòu)被破壞等。通過采用保護性耕作措施，可有效改善蕉園土壤肥力，提高蕉園土壤生產(chǎn)力，促進香蕉產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。土壤是農(nóng)業(yè)賴以發(fā)展的基礎(chǔ)性資源，土壤肥力直接影響著作物產(chǎn)量和品質(zhì)的形成。目前，蕉園管理過程中蕉農(nóng)為了避免其他植物與香蕉的水肥競爭，往往清除地面全部雜草，導(dǎo)致蕉園土壤大范圍的呈裸露狀態(tài)[3]，破壞了土壤結(jié)構(gòu)，造成了土壤板結(jié)、土壤保水保肥性能降低及土壤透水透氣性減弱等土壤退化問題[4]。另外，蕉園肥料施用不合理，導(dǎo)致土壤酸化及土壤中有害元素富集[5]。因此，為了改善蕉園土壤肥力狀況，提高蕉園土壤生產(chǎn)力，促進蕉園土壤可持續(xù)利用，需轉(zhuǎn)變目前的蕉園管理模式，采用用地養(yǎng)地為一體的管理措施。植物覆蓋措施是一種科學(xué)的土壤管理制度，中國于20世紀90年代引入植物覆蓋技[6]，植物覆蓋措施在不影響作物生長的前提下改善土壤理化性質(zhì)，這種模式較單一種植作物而言不僅增加了土壤中的生物量，而且提高了土壤的生產(chǎn)力，在空間分布及時間利用過程中形成了互利共生的關(guān)系，能夠增大土壤儲水量、改善土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤肥力、調(diào)節(jié)田間小氣候等功能[7]，對提高土壤生產(chǎn)力，促進中國農(nóng)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展有重要意義。土壤微生物是土壤的重要組成部分，推動整個土壤生態(tài)系統(tǒng)中的能量流動和物質(zhì)循環(huán)，在促進植物吸收養(yǎng)分及調(diào)節(jié)土壤肥力與健康等方面有著不可替代的作用[8]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)不僅受土壤溫度、水分、通氣性及土壤肥力等因素的影響，也受耕作措施的影響[9]，體現(xiàn)了土壤中各種生物化學(xué)過程的強度及方向，是土壤生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)的敏感性指標[10]。植物覆蓋措施通過覆蓋作物根部分泌的各種微生物，直接有效的增加蕉園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性；也可以通過改善田間小氣候間接提高蕉園土壤微生物多樣性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，土壤微生物多樣性研究將在土壤生態(tài)系統(tǒng)功能恢復(fù)及重建方面提供更多的理論依據(jù)[11]。植物覆蓋措施已廣泛應(yīng)用于提升果園的土壤肥力，但是由于與現(xiàn)階段蕉農(nóng)的種植理念相悖，有關(guān)于植物覆蓋對蕉園土壤微生物多樣性的研究較少，植物覆蓋能有效的將蕉園的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與土壤保持相結(jié)合，是用地養(yǎng)地為一體的保護性田間管理模式。本研究利用微生物Biolog鑒定技術(shù)探究植物覆蓋對蕉園土壤微生物多樣性的影響，以期為改善蕉園土壤質(zhì)量、促進香蕉產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗區(qū)位于云南省保山市潞江鎮(zhèn)(98°53′14″E，24°57′58″N)，海拔約700 m，年平均氣溫21.3℃，全年基本無霜，絕對最高氣溫40.4℃，絕對最低氣溫0.2℃，≥10℃活動積溫7800℃，年日照時數(shù)2333.7 h，年降水量750 mm，年蒸發(fā)量2100 mm，相對濕度70%，屬于亞熱帶干熱河谷氣候類型。土壤屬砂壤土，試驗地土壤、氣候條件和土壤類型均能滿足香蕉正常生長。香蕉品種選擇該試驗區(qū)主栽品種‘云蕉1號’，在該地區(qū)生長周期約1年。

1.2 試驗方法

試驗以常規(guī)種植行間地表裸露為對照(CK)，分別以行間種植自然生雜草覆蓋(Natural weed，NW)和人工種植豆科植物覆蓋(Cover plant，CP)為處理，研究香蕉種植區(qū)(Plant Zone，PZ)與覆蓋區(qū)(Cover Zone，CZ)土壤微生物功能多樣性差異。其中，自然生雜草以牛筋草[Eleusine indica(L.)Gaertn.]和馬唐[Digitaria sanguinalis(L.)Scop.]為主，豆科覆蓋植物品種為大翼豆[Macroptilium atropurpureum(DC.)Urb]。大翼豆種植時間為2018年4月，種植方式為條播。覆蓋區(qū)可以通過刈割和補播控制其高度及覆蓋度，無其它管理措施。在香蕉生長前期，雜草及大翼豆高度應(yīng)低于30 cm避免影響香蕉生長，需保證60%以上的覆蓋度才能達到覆蓋效果。試驗設(shè)4次重復(fù)，采用隨機區(qū)組排列。小區(qū)面積為100 m2，每小區(qū)定植香蕉苗40株。香蕉苗為寬窄行種植，寬行行距3.5 m，窄行行距1.5 m，香蕉苗在窄行上采取“之”字形種植，株距2.0 m，2018年7月定植香蕉苗，香蕉栽培和水肥管理參照當(dāng)?shù)叵憬斗N植模式。

1.3 測定指標及方法

土壤樣品用“S”形沿小區(qū)對角線采集，土壤樣品分為種植區(qū)和覆蓋區(qū)，種植區(qū)土壤為香蕉假莖周圍30 cm內(nèi)的土壤，覆蓋區(qū)土壤為寬行種植覆蓋植物的土壤。采樣時間為2019年7月和2020年7月，取樣深度為0～30 cm。

土壤微生物功能多樣性測定：采用Biolog系統(tǒng)鑒定法，用電子分析天平稱取10 g新鮮土壤加入到盛有90 mL滅菌生理鹽水(85%NaCl)的錐形瓶中，置于250 r/min的搖床上震蕩30 min，待土樣充分搖勻后取出靜置10 min，用移液槍吸取5 mL的上清液加入盛有45 mL滅菌生理鹽水的錐形瓶中，重復(fù)稀釋步驟得到10-3菌懸液，將此菌懸液接種到Biolog生態(tài)板中，每個微孔接種150 uL，接種好的板置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)，每隔24 h在微生物自動鑒定儀上測定590 nm處的吸光度值，共測定216 h。

平均顏色變化率(AWCD)：是反應(yīng)土壤微生物利用單一碳源的能力，是微生物代謝活性的一個重要標志，AWCD值越大，說明微生物活性越高。計算公式如式(1)所示。

式中Ci為第i個非對照孔在590 nm下的吸光度；R為對照孔吸光度；n為碳源種類數(shù)(n=31)；Ci-R≤0的孔在計算中記為0；每間隔24 h測定AWCD值，繪制AWCD與培養(yǎng)時間的動態(tài)變化圖。

采用接近漸近線的168 h處的吸光值進行標準化處理，計算表示微生物碳源代謝功能多樣性特征指數(shù)，包括：Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)：是評估微生物物種的豐富度與分布均勻程度的綜合指標。Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(D)：是對微生物多樣性方面的集中性的度量，反映土壤群落中最常見物種。McIntosh均勻度指數(shù)(U)：反映群落物種均勻度。McIntosh Evenness指數(shù)(E)為McIntosh均勻度指數(shù)。Richness Index豐富度指數(shù)(R)指被利用的碳源總數(shù)目，為每孔中(Ci-R)的值大于0.20的個數(shù)。計算公式如式(2)～(6)所示。

式中Pi為第i個非對照孔吸光度與所有非對照孔吸光度總和的比值；Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)；ni是第i孔的相對吸光度值；S為被利用的碳源數(shù)目。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)整理，使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物平均顏色變化率(AWCD)分析

AWCD值可以衡量土壤微生物對碳源的利用能力，是微生物代謝活性的重要標志，繪制AWCD隨微生物培養(yǎng)時間變化的動態(tài)曲線，可以表示不同培養(yǎng)時間土壤微生物代謝強度的動態(tài)變化。如圖1所示，AWCD曲線變化特征為：24 h后AWCD開始迅速升高，48 h后進入指數(shù)期，192 h后進入穩(wěn)定期。圖1中2019年種植區(qū)(PZ)，NW、CP、CK處理下土壤微生物AWCD曲線的增長幅度在0～168 h無明顯差異，但是在第192 h后NW和CP處理的土壤微生物AWCD曲線高于CK。圖1中2019年覆蓋區(qū)、2020年種植區(qū)及2020年覆蓋區(qū)，土壤微生物代謝強度變化特征為：CP處理的AWCD曲線增長幅度顯著高于NW和CK，說明大翼豆覆蓋下蕉園土壤微生物代謝活性較高，對于覆蓋區(qū)土壤微生物而言，其碳源代謝強度大小為：CP＞NW＞CK。

圖1 植物覆蓋下蕉園不同類型土壤微生物AWCD值變化

2.2 土壤微生物對不同碳源的利用

Biolog-ECO微平板的31種碳源可歸納為6類，分別為糖類、氨基酸類、羧酸類、聚合物類、胺類和酚酸類。用培養(yǎng)了168 h的碳源代謝強度值分別計算6類碳源的利用率（如圖2），發(fā)現(xiàn)不同年份種植區(qū)和覆蓋區(qū)土壤微生物對6種碳源的利用情況大致相同。2019年P(guān)Z區(qū)，CP和NW處理下土壤微生物對糖類、氨基酸類利用較好，對羧酸類、聚合物類利用較差。隨著覆蓋年限增加，2020年CP和NW處理促進了種植區(qū)土壤微生物對羧酸類及酚酸類利用。2019年CZ區(qū)，NW處理下土壤微生物對糖類碳源利用較好，CP處理下對胺類及酚酸類碳源利用較好，隨著覆蓋年限增加，CP和NW處理下土壤微生物對糖類和氨基酸類碳源的利用顯著高于對照區(qū)。

圖2 蕉園植物覆蓋對不同類型土壤微生物的碳源利用影響

2.3 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

如表1所示，隨著覆蓋處理的年限增加，土壤微生物各個指數(shù)都升高。對種植區(qū)(PZ)土壤微生物而言，2019年NW和CP處理下土壤微生物Shannon-Wiener、McIntos指數(shù)和Richness Index指數(shù)與CK處理差異顯著(P＜0.05)，到2020年，土壤微生物Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)在各處理間差異顯著，結(jié)果表現(xiàn)為：CP＞NW＞CK。對于覆蓋區(qū)(CZ)土壤微生物而言，2019年NW和CP處理下土壤微生物McIntosh、McIntosh Evenness指數(shù)和Richness Index指數(shù)與CK處理差異顯著(P＜0.05)，2020年CP處理下土壤微生物Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)與CK處理差異顯著，CP處理土壤微生物Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)較CK區(qū)分別高出2.11%、1.04%。

表1 植物覆蓋對蕉園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性影響

2.4 土壤微生物群落主成分分析

根據(jù)培養(yǎng)168 h的土壤微生物碳源代謝強度值，對種植區(qū)和覆蓋區(qū)各處理土壤微生物群落的碳源利用特征進行主成分分析。由圖3可知，對種植區(qū)(PZ)土壤微生物而言，PC1的貢獻率為27.6%，PC2的貢獻率為22.0%，其中CP分布在第一象限，NW分布在第二象限。對覆蓋區(qū)(CZ)土壤微生物而言，PC1的貢獻率為48.8%，PC2的貢獻率為19.3%，因此各處理間的差異主要體現(xiàn)在PC1軸，圖中CP主要分布在PC1的正半軸，NW和CK主要分布在PC1的負半軸。

圖3 蕉園植物覆蓋下不同類型土壤微生物群落功能的主成分分析

載荷圖反映了主成分中包含的因子種類，包含某一類的碳源因子數(shù)量越多，則證明該碳源對主成分的影響也越大。從表2可以看出，對種植區(qū)土壤微生物而言，對PC1貢獻較大的碳源有15中，其中羧酸類6種、氨基酸類4種、糖類3種、聚合物類2種，可見對PC1起主要作用的碳源為糖類、氨基酸類和羧酸類；在PC2中，貢獻較大的有3類碳源，其中糖類6種、胺類2種和酚酸類1種，對PC2起主要作用的碳源為糖類和胺類。

表2 蕉園植物覆蓋下種植區(qū)土壤微生物主成分載荷矩陣

從表3可以看出，對覆蓋區(qū)土壤微生物而言，對PC1貢獻較大的碳源有15中，其中糖類8種、氨基酸類4種、羧酸類5種、聚合物類2種，可見對PC1起主要作用的碳源為糖類、氨基酸類和羧酸類；在PC2中，貢獻較大的有3類碳源，其中糖類1種、胺類1種和酚酸類2種，對PC2起主要作用的碳源為酚酸類。

表3 蕉園植物覆蓋下覆蓋區(qū)土壤微生物主成分載荷矩陣

3 結(jié)論

植物覆蓋可以改善蕉園土壤微生物功能多樣性，且隨著覆蓋年限的增加效果越顯著，能一定程度解決蕉園土壤退化問題。不同覆蓋植物對土壤微生物功能多樣性影響差異顯著，大翼豆覆蓋較自然生雜草覆蓋更能改善土壤微生物群落多樣性，在蕉園裸露行間人工種植大翼豆的方法可有效減輕土壤退化程度，以植物多樣性促進土壤微生物多樣性的提高，提高香蕉園土壤健康可持續(xù)利用。

4 討論

土壤微生物在調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分循環(huán)和能量流動方面發(fā)揮著重要作用，并且對土壤管理措施非常敏感[12]，通過對蕉園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究可以在一定程度上表征蕉園土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性及土壤養(yǎng)分變化。土壤微生物群落對碳源的整體利用情況表征了土壤微生物活性狀況，通常對碳源利用的效果越強說明其微生物活性越高。本研究中Biolog-ECO微平板培養(yǎng)微生物的時間為216 h，0～24 h為滯后期，AWCD曲線增長緩慢，土壤微生物正在適應(yīng)微平板的環(huán)境；24～168 h為指數(shù)期，AWCD曲線指數(shù)型增長，土壤微生物代謝強度最旺盛；168 h以后為平緩期，AWCD曲線與橫坐標軸趨向平行，此時由于微平板中的碳源底物量無法維持微生物代謝，所以其代謝活性降低，該曲線符合微生物在Biolog-ECO板中的生長規(guī)律[13-15]。本研究認為連續(xù)兩年在蕉園裸露行間覆蓋植物能顯著提升土壤微生物碳源利用多樣性(P＜0.05)，并且大翼豆覆蓋(CP)＞自然生雜草覆蓋(NW)＞無覆蓋(CK)，相同條件下由于大翼豆也可以作為綠肥，提高土壤含氮量，增加土壤有機質(zhì)含量，所以大翼豆覆蓋比自然雜草覆蓋在提高土壤微生物活性方面更有效，因此在蕉園種植大翼豆更有利于蕉園土壤環(huán)境的改善[16]。該結(jié)果與王銳等[17]、魏樹偉等[18]的研究結(jié)果一致，認為植物覆蓋可以提高土壤微生物活性因為覆蓋作物不僅保持土壤水分，為微生物提供良好的生存環(huán)境，同時，覆蓋作物本身還有大量有機質(zhì)和N、P、K等元素，還田以后為土壤微生物提供了豐富的營養(yǎng)，促進土壤微生物的繁殖。

地上植物不同，土壤微生物數(shù)量及碳源利用類型也不同，土壤微生物對碳源利用規(guī)律直接反映了其代謝偏好[19]。Biolog-ECO生態(tài)板中，至少有9中碳源是根系分泌物的組分，本研究結(jié)果表明覆蓋區(qū)土壤微生物在NW與CP處理之間的碳源利用差異較大[20]。研究發(fā)現(xiàn)覆蓋區(qū)土壤微生物對糖類及氨基酸類碳源的利用較CK區(qū)高，而氨基酸類碳源大部分來自植物根系分泌物[21]，糖類極易被微生物同化，可以形成碳源比較豐富的環(huán)境[22]，說明植物覆蓋可以通過增加根系分泌物或促進土壤中的糖類形成，為微生物生長繁殖提供物質(zhì)保障，從而提高土壤微生物活性及多樣性。酚酸類化合物大部分是三羧酸循環(huán)的中間體，對土壤微生物的活性影響很大，土壤中的酚酸類物質(zhì)通過改變土壤養(yǎng)分、pH及化感作用等顯著影響土壤微生物的多樣性及群落結(jié)構(gòu)[23]，本研究中隨著植物覆蓋年份的增加土壤微生物對酚酸類碳源的利用能力增強，說明植物覆蓋可以通過提高土壤中酚酸類碳源促進土壤微生物多樣性。

目前土壤微生物Simpson(D)指數(shù)、McIntosh(U)和Shannon-Wiener(H)指數(shù)被廣泛應(yīng)用于衡量土壤微生物多樣性[24]。本研究發(fā)現(xiàn)植物覆蓋措施可以顯著提高香蕉種植區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性、優(yōu)勢度及微生物分布的均勻度(P＜0.05)，該結(jié)果與鐘哲科等[25]的研究結(jié)果一致，其原理在于覆蓋作物有利于土壤增溫保濕[26]、促進土壤的物質(zhì)循環(huán)，從而提高香蕉種植區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)均勻度。本研究中隨著覆蓋年限的增加種植區(qū)NW、CP間土壤微生物Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)差異顯著，且CP＞NW，說明植被類型是影響種植區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的重要因素之一，在環(huán)境條件一致的情況下，不同植物對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響不同[27]。對于覆蓋區(qū)土壤微生物而言，NW和CP處理下土壤微生物McIntosh(U)、McIntosh Evenness(E)、Richness Index(R)指數(shù)較 CK顯著增強，這是因為覆蓋作物不僅可以通過其根系活動直接改善土壤的團粒結(jié)構(gòu)，為微生物生長繁殖提供良好的環(huán)境，而且還為土壤中的微生物提供了豐富的碳源、氮源和其他所需養(yǎng)分，有利于微生物的生長繁殖，從而提高微生物活性[28-30]。大翼豆最突出的特點是耐高溫干旱，并且具有抑制草害、保持水土、土改土壤肥力等特點，被廣泛應(yīng)用于改善干熱河谷地區(qū)土壤生態(tài)條件[31]。本研究結(jié)果表明，CP土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的McIntosh均勻度指數(shù)、Richness Index豐富度指數(shù)及McIntosh Evenness指數(shù)較NW上升效果更顯著，表明豆科牧草的固氮作用使土壤中的C/N下降，加快了土壤中養(yǎng)分的分解，提高了土壤微生物活性，大翼豆覆蓋對改善干熱河谷地區(qū)土壤肥力具有重要意義。

主成分分析結(jié)果表明，不同處理土壤微生物群落的代謝多樣性有明顯差異。覆蓋區(qū)土壤微生物碳源利用特征是：CP能較好的利用糖類、氨基酸類及羧酸類碳源，NW能較好的利用胺類和酚酸類碳源，CK對各類碳源利用較弱，因此地上植物群落結(jié)構(gòu)差異是導(dǎo)致土壤微生物功能多樣性表現(xiàn)出空間異質(zhì)性的主要原因，這與井趙斌等[32]關(guān)于植物覆蓋對獼猴桃園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響的研究結(jié)果一致。種植區(qū)CK、CP和NW都能很好的利用氨基酸類和羧酸類碳源，而CP和NW也能較好地利用糖類和胺類碳源，這一結(jié)果可能與在蕉園管理過程中化肥和農(nóng)藥降解到地表有關(guān)，土壤微生物對農(nóng)藥及化肥反應(yīng)敏感，從而影響其碳源利用特征。糖類、氨基酸類和羧酸類碳源是優(yōu)勢碳源也是敏感碳源[33]，本研究中，糖類、氨基酸類和羧酸類碳源是土壤微生物的主要碳源類型，這3類碳源中微生物對糖類的利用率最高，這與王楠楠等[34]的研究結(jié)果一致。