我國近海裸胸鱔屬魚類新記錄種—黏裸胸鱔（Gymnothorax mucifer）形態(tài)與分子系統(tǒng)學研究

張國慶 ，楊杰鑾，李培源，梁馨藝，梁日深*，林蠡*，李清清

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 動物科技學院，廣東 廣州 510225；2.廣東省水環(huán)境與水產(chǎn)品安全工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510225；3.廣州市水產(chǎn)病害與水禽養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510225)

1 引言

裸胸鱔屬（Gymnothorax）隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes），鰻鱺總目（Anguillomorpha），鰻鱺目（Anguilliformes），海鱔科（Muraenidae），海鱔亞科（Muraeninae），廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶海區(qū)。裸胸鱔屬是海鱔科里面種類最多的一個屬，世界上記錄有100 余種[1-3]，我國有20～30 種[4-16]，不同分類資料收錄的種類數(shù)目有所不同。其中《中國魚類系統(tǒng)檢索》[4]收錄20 種、《臺灣魚類志》[6]收錄27 種、《中國海洋魚類》[12]與《中國海洋生物名錄》[15]收錄種類最多，均為37 種。主要分布于東海、南海及臺灣海峽。

目前，國內(nèi)有關(guān)裸胸鱔屬魚類研究國內(nèi)報道極少，僅在分子系統(tǒng)發(fā)育[17-18]、消化道結(jié)構(gòu)[19]及遺傳多樣性[20]等方面有少量研究。國外報道相對較多，研究主要集中于裸胸鱔基礎(chǔ)生物學及種質(zhì)資源方面，近些年在裸胸鱔種質(zhì)分析上有不少新種發(fā)現(xiàn)的報道，如Gymnothorax pharaonis[3]、Gymnothorax smithi[21]、Gymnothorax pseudotile[22]、Gymnothorax visakhaensis[23]、Gymnothorax pseudome-lanosomatus[24]等。自2015 年 以來已有5 種裸胸鱔屬新種被記錄，揭示了裸胸鱔屬資源還存在巨大的可挖掘空間，物種分類信息有待進一步更新與完善。

黏裸胸鱔（Gymnothorax mucifer）（Snyder,1904）體色為棕黃色，體表布滿細小、彌散的樹枝狀不規(guī)則斑紋，臀鰭邊緣為白色。目前我國的分類資料均無黏裸胸鱔的信息，包括比較系統(tǒng)、權(quán)威的物種檢索資料，如《中國魚類系統(tǒng)檢索》《中國海洋魚類》《臺灣魚類志》等。國外針對黏裸胸鱔的研究也很少，并且其物種有效性也存在一定爭議。有研究認為，黏裸胸鱔其實為蠕紋裸胸鱔（Gymnothorax kidako）的同種異名[25-27]，但近些年也有研究揭示兩者為獨立的物種，兩種裸胸鱔在下頜特征、牙齒及脊椎骨數(shù)量等形態(tài)性狀方面存在差異[28-29]。本研究于2020-2021 年期間在福建省廈門市近海水產(chǎn)市場采集了4 尾黏裸胸鱔的樣品，為我國大陸近海一個新記錄種。針對其具體的形態(tài)特征進行詳細測量分析，同時采集蠕紋裸胸鱔、雪花斑裸胸鱔（Gymnothorax niphostigmus）等多種與黏裸胸鱔形態(tài)相近的裸胸鱔種類進行比較，結(jié)合DNA 條形碼COI 基因開展分子系統(tǒng)分類研究，明確黏裸胸鱔的物種有效性，為我國裸胸鱔屬魚類系統(tǒng)分類及物種名錄的修訂提供分類基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

黏裸胸鱔樣品于2020-2021 年在福建省廈門市近海水產(chǎn)市場（30.060 7°N,122.354 6°E）采集，共獲得樣品4 尾。另外采集了蠕紋裸胸鱔、雪花斑裸胸鱔、?，斒下阈伧X（Gymnothorax emmae）、云紋裸胸鱔（Gymnothorax chilospilus）、白斑裸胸鱔（Gymnothorax prionodon）等與黏裸胸鱔形態(tài)相似的種類比較分析。采集樣品鮮活狀態(tài)下進行高清拍攝，標本于仲愷農(nóng)業(yè)工程學院動物科技學院水產(chǎn)養(yǎng)殖系實驗室保存（圖1，圖2）。

圖1 黏裸胸鱔Fig.1 Gymnothorax mucifer（Snyder,1904）

圖2 對比種類Fig.2 Comparison species

2.2 實驗方法

2.2.1 形態(tài)學特征研究分析

本研究參考張春光[11]、B?hlke 和Randall[28]的測量方法，對采集的4 尾黏裸胸鱔樣品的形態(tài)特征進行描述。利用直尺及游標卡尺準確測量樣品全長、體長、體高、肛前體長、肛后體長、頭長、頭高、吻長、上頜長、下頜長、眼徑、眼間距、眼后頭長、背鰭前距、臀鰭前距、背鰭基長、臀鰭基長等可量性狀，精確到1 mm；采用直接計數(shù)方式統(tǒng)計前頜齒、上頜齒、下頜齒、犁骨齒、前頜骨中央齒的數(shù)目以及脊椎骨數(shù)、背鰭鰭條數(shù)、臀鰭鰭條數(shù)等可數(shù)性狀（圖3，圖4）。

圖3 黏裸胸鱔外部可量性狀示意圖Fig.3 Schematic diagram of external measurable traits of Gymnothorax mucifer

圖4 黏裸胸鱔牙齒結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 Schematic diagram of teeth structure of Gymnothorax mucifer

2.2.2 分子DNA 條形碼基因分析

（1）DNA 提取

取約20 mg 樣品肌肉組織，使用海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司），按照說明書進行DNA 提取。提取4 尾黏裸胸鱔以及蠕紋裸胸鱔、雪花斑裸胸鱔、?，斒下阈伧X、云紋裸胸鱔、白斑裸胸鱔等總基因組DNA，溶解于80 μl 滅菌水中。利用1%瓊脂糖凝膠對提取的DNA 進行電泳檢測，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）PCR 擴增與測序

PCR 擴增引物采用魚類COI 基因序列的通用引物，為COI-F1:5′-TCAACYAATCAYAAAGATAT YGGCAC-3 ′、COI-R1:5 ′-ACTTCYGGGTGRCCR AARAATCA-3′[30]。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包括PCR Mastermix 12.5 μL，滅菌水10.5 μL，上、下游引物各為0.5 μL，DNA 模板1 μL。擴增條件為94℃預(yù)變性5 min、94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，35 個循環(huán)，最后72℃再延伸7 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取擴增成功的樣品用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒純化回收后送至天一輝遠生物技術(shù)有限公司進行測序。

（3）分子系統(tǒng)進化分析

將測得的COI 基因片段于美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）進行相似性檢索，驗證序列的正確性。同時，在GenBank 上下載所有學名為Gymnothorax mucifer及其他相關(guān)裸胸鱔的COI序列一起分析（表1），利用Clustal W 軟件對序列進行排列比對[31]，去掉兩端不規(guī)則冗余序列，保留同源序列于MEGA 7.0 軟件分析堿基組成、遺傳距離等信息[32]。以裸海鱔屬斑馬裸海鱔（Gymnomuraena zebra）為外類群，采用最大似然法與貝葉斯法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，最大似然樹在RAxML 8.0 軟件完成[33]，分支置信度利用1 000 次重復(fù)抽樣分析。貝葉斯樹在 MrBayes 3.1.2 軟件中完成[34]，隨機選取起始樹，計算 1 000 000 代，取樣代數(shù)為100，節(jié)點置信度由后驗概率提供。

表1 本研究分析的裸胸鱔COI 基因序列信息Table 1 Information of the COI sequences of Gymnothorax species cited in this study

3 實驗結(jié)果

3.1 黏裸胸鱔（Gymnothorax mucifer）（Snyder,1904）形態(tài)特征

3.1.1 新種記錄

4 尾黏裸胸鱔樣品于2020-2021 年采自福建省廈門市近海水產(chǎn)市場，編號為GMFJXM1-GMFJXM4，形態(tài)測量數(shù)據(jù)見表2。4 尾樣品全長范圍為515～617 mm，全長為體高（42～56 mm）的10.71～12.79 倍，為背鰭前距（48～58 mm）的9.42～10.91 倍，為臀鰭前距（245～286 mm）的2.10～2.16 倍，為頭長（62～75 mm）的8.00～8.39 倍。頭長范圍為上頜長（34～40 mm）的1.82～2.18 倍，為下頜長（37～45 mm）的1.67～1.85 倍，為眼徑（5～7 mm）的10.57～12.40 倍，為眼間距（6～11 mm）的6.73～10.67 倍。

表2 黏裸胸鱔形態(tài)性狀測量數(shù)據(jù)Table 2 Morphometric measurement information of Gymnothorax mucifer

3.1.2 鑒別特征

黏裸胸鱔體為黃棕色，吻部偏紫色。體表布滿細小、彌散的樹枝狀不規(guī)則棕色橫紋，相連成網(wǎng)狀；紋路在尾部加深加粗，使尾部呈現(xiàn)網(wǎng)格狀白斑。口角具4～6 條縱向黑痕。臀邊緣為白色，不延續(xù)至尾端，尾部被棕色網(wǎng)紋分隔呈現(xiàn)一列白斑。平均椎骨式為6-47-130。

3.1.3 性狀描述

黏裸胸鱔牙齒尖細呈錐狀，前頜齒1 行，每側(cè)有4～8 個大犬齒。上頜齒1 行，齒較前頜齒小且向后傾斜，每側(cè)8～10 個；其中有2 尾上頜內(nèi)部每側(cè)均具有4 個細小尖形牙。中央齒細長且單行，數(shù)量2～4 個不等；犁骨齒較小，單行或交錯排列，為3～9 個。下頜齒1 行，每側(cè)有14～20 個，前4～5 對較大，其余牙齒較小且大小不等。

4 尾黏裸胸鱔樣品背鰭鰭條數(shù)為293～408，臀鰭鰭條數(shù)為213～286。總脊椎骨數(shù)為117～139，背前脊椎骨數(shù)為4～8，肛門前脊椎骨數(shù)為43～56，平均椎骨式為6-47-130；椎體呈雙凹形，每一椎體的中心均有小孔。

體中等長，頭中等大；軀干部呈圓柱形，尾部較側(cè)扁，完全裸露；吻短；前鼻孔位于近吻端，呈管狀，中等細長；后鼻孔位于眼前緣上方，圓形；眼中等大，新鮮標本的眼睛虹膜微黃，眼間距稍大于眼徑；上下頜基本等長；體為黃棕色至深棕色，頭部前端偏紫色，喉部、腹部顏色較淺；眼后頭部網(wǎng)紋密集，部分形成細小、淡黃色斑點，斑點分布因物種個體而異；下頜處無斑紋；身體布滿細小、稀疏、樹枝狀不規(guī)則褐色橫紋，連成網(wǎng)狀；紋路在尾部顏色加深加粗，相連圍繞，使尾部呈現(xiàn)明顯網(wǎng)格狀白斑；口角具4～6 條縱向黑痕；鰓孔周圍顏色呈黑色，較明顯；背鰭、臀鰭均與尾鰭相連，無胸鰭；背鰭始于鰓孔前，中等高；肛門位于體中央前方，臀鰭較淺，不如背鰭發(fā)達；臀鰭邊緣為白色且顏色不連續(xù)至尾尖，尾部被棕色紋路分割呈現(xiàn)一列白色斑點。

3.2 黏裸胸鱔與近緣裸胸鱔種類形態(tài)差異比較

根據(jù)《中國魚類系統(tǒng)檢索》[4]、《中國動物志》[11]、《中國海洋魚類》[12]、《臺灣魚類志》[6]等形態(tài)分類資料，結(jié)合在線魚類數(shù)據(jù)庫[2]，匯總出黏裸胸鱔及與其形態(tài)相似的5 種裸胸鱔可區(qū)分彼此的外部特征性狀，對黏裸胸鱔及相關(guān)裸胸鱔進行比較分析（表3）。

表3 黏裸胸鱔與相關(guān)近緣裸胸鱔形態(tài)特征比較Table 3 Comparion analysis of morphological characteristics among Gymnothorax mucifer and related Gymnothorax species

3.3 黏裸胸鱔DNA 條形碼COI 基因分析及系統(tǒng)進化關(guān)系

測序獲得本研究4 尾黏裸胸鱔及蠕紋裸胸鱔、雪花斑裸胸鱔、云紋裸胸鱔、埃瑪氏裸胸鱔和白斑裸胸鱔的COI 基因序列，結(jié)合GenBank 下載的裸胸鱔COI 基因序列（表1）共同分析，經(jīng)排列比對，去除兩端冗余獲得一致序列636 bp。序列中T、C、A、G 堿基含量分別為29.6%、27.5%、23.7%、19.2%，A+T 含量（53.3%）高于C+G（46.7%）。序列中保守位點482 個，變異位點154 個，簡約信息位點138 個，轉(zhuǎn)換顛換比為4.24?；贙imura-2-parameter 模型計算各裸胸鱔種內(nèi)及種間遺傳距離（表4）。6 種裸胸鱔種內(nèi)遺傳距離范圍為0.006～0.019，平均遺傳距離為0.009。種間遺傳距離為0.051～0.164，平均遺傳距離為0.111。比較黏裸胸鱔與其余5 種裸胸鱔遺傳距離可知，黏裸胸鱔與雪花斑裸胸鱔之間遺傳距離最小（0.051），與云紋裸胸鱔遺傳距離最大（0.146）。以斑馬裸海鱔為外群，采用最大似然法和葉貝斯法構(gòu)建的分子系統(tǒng)進化樹如圖5、圖6 所示，兩種方法構(gòu)建的進化樹拓撲結(jié)構(gòu)基本相同，節(jié)點均擁有較高支持率。進化樹上，同種裸胸鱔不同個體均能緊密聚在一起，形成種內(nèi)單系分支。本研究的4 尾黏裸胸鱔與GenBank 中的黏裸胸鱔9 條序列一起，形成黏裸胸鱔的單系分支，位于進化樹頂部。對于黏裸胸鱔與其他幾種裸胸鱔分類關(guān)系，黏裸胸鱔與雪花斑裸胸鱔關(guān)系最近，兩者聚為緊密姐妹分支，隨后該分支再與蠕紋裸胸鱔相聚。云紋裸胸鱔與黏裸胸鱔的分類地位最遠，位于進化樹的基部，其次分別為?，斒下阈伧X與白斑裸胸鱔。

圖5 基于COI 基因序列利用最大似然法構(gòu)建6 種裸胸鱔屬魚類分子系統(tǒng)進化樹Fig.5 Molecular phylogenetic trees of 6 Gymnothorax species constructed using maximum likelihood method based on COI gene sequences

表4 基于COI 基因序列6 種裸胸鱔的種內(nèi)及種間遺傳距離Table 4 Intra-specific and inter-specific genetic distance among 6 Gymnothorax species for COI sequences

4 討論

我國記錄的裸胸鱔屬魚類有20～30 種[4-16]，早期1962 年編著的《南海魚類志》[8]收錄有18 種，后續(xù)分類資料收錄物種信息逐漸增多，《中國魚類系統(tǒng)檢索》[4]記錄20 種，《臺灣魚類志》[6]記錄27 種，數(shù)量最多的為2016 年陳大剛與張美昭主編的《中國海洋魚類》[12]及2008 年劉瑞玉主編的《中國海洋生物名錄》[15]，均為37 種。而在目前的形態(tài)分類資料中，均無黏裸胸鱔（Gymnothorax mucifer）（Snyder,1904）的物種記錄，甚至不曾出現(xiàn)過這一學名。國外關(guān)于黏裸胸鱔的研究報道也較少，其為十分罕見的裸胸鱔種類。前期僅在澳大利亞、新喀里多尼亞及夏威夷群島等海域有黏裸胸鱔記錄，但曾一度被誤認為是蠕紋裸胸鱔[25-27]，直至B?hlke 與Randall[28]提出兩者為不同物種。Huang等[29]2019 年在臺灣東北部太平洋海區(qū)附近也曾采集過黏裸胸鱔樣品，并比較黏裸胸鱔、蠕紋裸胸鱔的特征差異，認為兩者應(yīng)為獨立的物種。本研究4 尾黏裸胸鱔采集于福建省廈門市近海水產(chǎn)市場，形態(tài)特征分析跟B?hlke 與Randall[28]、Huang 等[29]關(guān)于黏裸胸鱔的物種特征描述及圖片信息基本一致。本研究中4 尾黏裸胸鱔為在我國大陸近海（渤海、黃海、東海、南海）首次記錄的種類。針對該物種進行具體形態(tài)學及分子DNA 條形碼鑒定，驗證為黏裸胸鱔，可知我國沿海也有該裸胸鱔物種的分布，為我國裸胸鱔屬魚類物種名錄修訂及分類學研究提供了依據(jù)。

黏裸胸鱔體色為黃棕色，體表布滿較為彌散的樹枝狀不規(guī)則橫紋，臀鰭邊緣白色，與蠕紋裸胸鱔的形態(tài)十分相似。前期部分形態(tài)學研究認為兩者為同一物種[25-27]。世界魚類數(shù)據(jù)庫（Fishebase）目前也將黏裸胸鱔標注為蠕紋裸胸鱔的同種異名[2]。而比較分析黏裸胸鱔與蠕紋裸胸鱔詳細形態(tài)學特征發(fā)現(xiàn)，兩者體表也存在較明顯的差異。蠕紋裸胸鱔頭部黃色，身體環(huán)繞較粗大、明顯的樹枝狀多突起不規(guī)則褐色橫紋，橫紋特征在尾部變密，相連圍繞，將尾部分隔成許多不規(guī)則多突起的白斑，臀鰭白色邊緣延續(xù)至尾端；黏裸胸鱔頭部淡紫色，身體環(huán)繞較細小稀疏、彌散的樹枝狀不規(guī)則橫紋，橫紋在尾部加深加粗，相連圍繞，將尾部分隔成網(wǎng)格狀白斑，臀鰭白色邊緣不延續(xù)至尾端。

在DNA 條形碼COI 基因分析方面，本研究中4 種黏裸胸鱔COI 序列經(jīng)NCBI 在線比對，與在線公布的G.mucifer的同源性最高，達到99%以上，分子水平驗證為黏裸胸鱔G.mucifer。通過與蠕紋裸胸鱔、雪花斑裸胸鱔等5 種與黏裸胸鱔形態(tài)接近的裸胸鱔COI 序列比較分析可知，黏裸胸鱔與其他5 種裸胸鱔的遺傳距離范圍為0.051～0.146，其中與雪花斑裸胸鱔遺傳距離最小（0.051），與云紋裸胸鱔的遺傳距離最大（0.146），均遠大于Hebert 等[36]推薦的2%（0.020）作為區(qū)分不同物種的最小遺傳距離，同時遠大于本研究6 種裸胸鱔種內(nèi)不同個體的遺傳距離范圍（0.006～0.019）及目前有關(guān)裸胸鱔屬魚類COI 基因種內(nèi)遺傳距離變異范圍（最小為0，最大為0.037，大部分在0.020以內(nèi)）[37-39]。可知分子水平上，黏裸胸鱔為區(qū)分于其他5 種裸胸鱔的獨立物種。與黏裸胸鱔形態(tài)最為接近且處于同種異名爭議的蠕紋裸胸鱔，兩者遺傳距離高達0.074，在分子水平上存在較大差異。進化樹上，黏裸胸鱔優(yōu)先與雪花斑裸胸鱔聚為一支，該分支再與蠕紋裸胸鱔相聚。可知，相對于雪花斑裸胸鱔，蠕紋裸胸鱔與黏裸胸鱔分子水平的親緣關(guān)系相對較遠，結(jié)合形態(tài)學的特征比較分析可知，兩種裸胸鱔應(yīng)為獨立的物種，并非同種異名。