循環(huán)腫瘤細胞在食管癌根治性放療中的臨床意義

顧建建

(江蘇省南通市通州區(qū)人民醫(yī)院, 江蘇 南通, 226300)

約90%以上的食管癌患者的病理結(jié)果為鱗狀細胞癌[1-2]。腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移和復發(fā)是導致食管癌患者死亡的最主要原因。然而，在轉(zhuǎn)移或者復發(fā)的早期階段，患者臨床表現(xiàn)不夠明顯，常規(guī)檢查未能發(fā)現(xiàn)[3]。目前，放射療法是食管癌的有效治療手段之一。研究[4]顯示，循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)在腫瘤發(fā)展的早期即可從原發(fā)灶脫落進入血液循環(huán)或者淋巴循環(huán)而導致全身播散，這對惡性腫瘤的早期診斷、療效評估及疾病預后等具有重要的臨床價值[5]。本研究采用免疫磁珠陰性富集聯(lián)合免疫熒光原位雜交技術(shù)檢測食管鱗癌患者的CTCs，探討CTCs與食管鱗癌臨床特征及預后的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2019年8月11日—2021年3月4日南通市通州區(qū)人民醫(yī)院收治的114例食管鱗癌患者的臨床資料，其中男88例，女26例，年齡48～87歲，平均(64.39±8.38)歲。所有患者經(jīng)胃鏡活檢確診為食管鱗癌，且未接受過手術(shù)、放射治療、化療，卡氏功能狀態(tài)評分(KPS評分)≥70分，預期生存時間超過3個月。TNM分期根據(jù)《食管癌放射治療指南(2019版)》[6]評定，其中50例不可根治切除或不愿接受手術(shù)的局部晚期食管鱗癌患者在檢測CTCs后接受了根治性放療，并在放療結(jié)束1周內(nèi)再次行CTCs檢測，其中男35例，女15例，年齡49～87歲，平均(65.32±9.52)歲。

1.2 方法

1.2.1 CTCs檢測: 采集患者外周靜脈血5 mL, 抗凝處理后室溫保存, 24 h內(nèi)行富集處理。將血液離心、棄上清、去除血紅蛋白及血紅素。在樣本中加入紅細胞裂解液，再次離心、棄上清、去除紅細胞，白細胞及稀有細胞便沉淀下來。吸取適量磁珠洗滌并加入上述樣本中，混勻，使白細胞與磁珠充分結(jié)合。再次離心、去除相結(jié)合的磁珠與白細胞。濃縮體積并去除殘留磁珠后進行涂片。進行免疫熒光染色，得到表面標記CD45陰性、8號染色體著絲粒探針(CEP-8)陽性、4′, 6-二瞇基-2-苯基吲哚(DAPI)陽性的CTCs, 由3位工作人員獨立進行鏡下讀片，平均數(shù)為CTCs計數(shù)(圖1)。目前尚無國際化判定標準，本研究取CTCs≥3個為陽性。

A: CD45陰性; B: CEP-8陽性; C: DAPI陽性; D: CTCs合成圖。箭頭所示為CTCs。圖1 熒光原位雜交技術(shù)顯示的CTCs(放大倍數(shù)400倍)

1.2.2 治療方案及療效評價: 50例食管鱗癌患者均采用三維適形放療，設(shè)備為德國西門子直線加速器。放療處方劑量為1.8～2.0 Gy/次, 1次/d, 5次/周，放療25次后進行第2次定位，并局部縮野推量，總劑量為60.0～70.0 Gy。依據(jù)患者放療前、二次定位CT及放療后3周的CT結(jié)果進行近期療效評價，評價標準參考世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的《實體瘤客觀療效評價標準》[7]相關(guān)內(nèi)容，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進展(PD)。緩解率(RR)=(CR+PR)/總例數(shù)×100%。放療完成后3周進行序貫化療，并于每2個月對患者進行復查，無進展生存期(PFS)定義為從放療開始至腫瘤進展的時間，隨訪截至2021年9月1日。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，采用雙側(cè)檢驗，生存率采用 Kaplan-Meier方法，繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗差異的顯著性。應用Cox比例風險模型進行多因素分析以判定獨立預后因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 CTCs與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系

114例食管鱗癌患者CTCs陽性率與年齡、性別、腫瘤位置無相關(guān)性(P>0.05)，與腫瘤T分期、N分期、M分期以及臨床分期有相關(guān)性(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 114例食管鱗癌患者CTCs與臨床病理特征關(guān)系

2.2 放療前后CTCs的變化

50例患者放療前的CTCs陽性率為62.00%(31/50), 放療后的CTCs陽性率為52.00%(26/50), 放療前后的CTCs陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.020,P=0.313)。

2.3 CTCs與食管鱗癌患者放療近期療效的關(guān)系

50例患者中, 33例患者放療后評價為緩解(CR+PR), 17例評價為SD。與CTCs陽性患者相比 ,CTCs陰性患者放療前及放療后的RR均更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 放療前陽性而放療后陰性患者的RR高于放療前后均為陽性、放療前陰性而放療后陽性、放療前后均為陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.644,P=0.009)。見表2。

表2 50例食管鱗癌患者CTCs與放療后近期療效的關(guān)系

2.4 CTCs與食管鱗癌患者放療后PFS的關(guān)系

截至2021年9月1日，本研究50例患者均完成隨訪，共有27例患者出現(xiàn)疾病進展。采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線并進行生存分析，放療前CTCs陰性患者PFS為18.62個月(95%CI: 15.24～21.99), 高于CTCs陽性患者的13.84個月(95%CI: 10.01～17.68), 差異有統(tǒng)計學意義(P=0.048)。放療后CTCs陰性患者PFS為19.58個月(95%CI: 16.51～22.67), 高于CTCs陽性患者的12.13個月(95%CI: 7.94～16.32), 差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)。見圖2。

A: 放療前生存曲線; B: 放療后生存曲線。

2.5 多因素Cox回歸分析PFS的影響因素

年齡、性別、T分期、N分期、放療前CTCs與PFS無相關(guān)性(P>0.05), 腫瘤臨床分期、放療后CTCs是食管鱗癌患者的獨立預后因子(P<0.05)。見表3。

表3 食管鱗癌患者放療后PFS的COX回歸分析

3 討 論

食管癌是常見的預后較差的惡性腫瘤，其5年生存率僅為20%左右，腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移和復發(fā)是其主要原因[8]。目前，食管癌檢測的主要手段是影像學檢測及腫瘤標志物檢測，但是影像學檢查無法及時發(fā)現(xiàn)腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移，而食管癌也缺乏特異性的腫瘤標志物。CTCs可從腫瘤處脫落并通過循環(huán)系統(tǒng)及淋巴系統(tǒng)進行全身播散，是腫瘤轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對CTCs的檢測較傳統(tǒng)檢查能更及時地對腫瘤進展進行評估，且具有易于獲得、相對無創(chuàng)、可以反復檢測等優(yōu)點，具有成為“實時腫瘤活檢”的可能性。由于CTCs在外周血中含量極少, 106～108個血細胞中僅存在1個CTCs[9], 因此在CTCs檢測中富集是必要的。較為常見的富集技術(shù)是形態(tài)學富集法和免疫磁珠抗原依賴技術(shù)[10], 其中形態(tài)學富集法具有操作便捷、價格相對較低等優(yōu)點，但缺乏特異性，存在漏檢可能; 免疫磁珠抗原依賴技術(shù)分為陽性及陰性富集法，前者通過識別腫瘤細胞表達的上皮細胞黏附分子(EpCAM)進行直接富集，后者通過去除CD45陽性的白細胞進行間接富集。本研究采用的陰性富集法不依賴CTCs表面標志物的表達，具有更高的檢測率，而且所檢出的CTCs具有更高的活性。

本研究發(fā)現(xiàn)CTCs與T分期、N分期、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期有相關(guān)性，與年齡、性別、腫瘤部位無相關(guān)性。目前CTCs在乳腺癌、肺癌、胃癌等腫瘤中得到廣泛研究，但在食管癌方面的研究較少，且研究結(jié)果也存在差異。MATSUSHITA D等[11]對90例食管癌患者的研究顯示, CTCs水平與遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期有相關(guān)性，與T分期、N分期無相關(guān)性。LI SP等[12]報道食管癌CTCs水平僅與臨床分期有關(guān)。QIAO Y等[13]研究顯示, CTCs水平與T分期、N分期、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。造成上述研究結(jié)果差異的原因可能是各研究檢測方法有差異及研究樣本不同所致，食管癌外周血CTCs仍缺乏大樣本的研究報道，但總體上CTCs能反映食管癌的進展程度, CTCs的檢測能對食管癌病情進行有效評估。在I期食管癌中, CTCs陽性率為22.22%, 證明食管癌早期即可發(fā)生腫瘤細胞脫離原發(fā)灶進入血液循環(huán)，而此類患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的風險較高，因此CTCs能篩選食管癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的高危人群。本研究中，非轉(zhuǎn)移食管鱗癌CTCs陽性率為54.81%, 表明CTCs在腫瘤未發(fā)生轉(zhuǎn)移前即可被檢測到，較傳統(tǒng)影像學檢測更為靈敏。

化療能有效降低患者CTCs水平，故本研究在患者行序貫化療前行CTCs檢查，且重點觀察放療對CTCs水平的影響。本研究中，患者放療后CTCs陽性率較放療前有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 考慮放療作為局部治療手段較化療無法在短期內(nèi)顯著降低CTCs水平，同時本研究樣本量較小，需要擴大樣本量進一步研究。本研究顯示放療前后CTCs水平能評估患者近期RR，且CTCs放療前陽性而放療后陰性患者RR較高，提示放療對腫瘤原發(fā)灶的有效控制可能與放療誘導腫瘤細胞死亡、促進免疫性抗原釋放、激活機體抗腫瘤免疫效應有關(guān)[14-15]。本研究4例患者出現(xiàn)放療前陰性而放療后陽性的情況，且療效評估均為SD, 提示放療效果不佳時CTCs水平會進一步提高。研究[16-18]指出CTCs與乳腺癌、肺癌、胃癌等惡性腫瘤的預后密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)CTCs放療前后水平與食管鱗癌患者預后密切相關(guān)，即CTCs水平高的患者的預后較差、PFS較低，表明CTCs也可以作為食管鱗癌的預后評價指標，與WOESTEMEIER A等[19]報道一致。本研究還顯示放療后CTCs、腫瘤臨床分期可以作為食管鱗癌放療后的獨立預后因子，因此CTCs檢測對食管鱗癌患者的臨床診治及預后評價具有較大的指導意義。

綜上所述，本研究顯示食管鱗癌患者CTCs與T分期、N分期、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期有相關(guān)性，CTCs是食管鱗癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的重要前提，對評價腫瘤的進展程度具有重要意義; CTCs水平能有效反映食管鱗癌放療患者近期RR及遠期療效，是食管鱗癌預后的重要指標。