人β-防御素3轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞成骨分化潛能及抗牙周炎致病菌的作用

蔣莉莉, 張艷東, 胡碩紅

(1. 河北省張家口宣鋼醫(yī)院 口腔科, 河北 張家口, 075100;2. 河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院 重癥科, 河北 張家口, 075100;3. 海南省?？谑锌傖t(yī)院 口腔科, 海南 海口, 570100)

難治性牙周病是發(fā)生在牙周支持組織的慢性感染性疾病，是造成成人牙齒缺失的重要原因[1]。目前臨床主要治療方法為全身局部應(yīng)用抗生素及牙周引導(dǎo)組織再生手術(shù)等，但成功率較低[2-3]。β-防御素是一類重要的內(nèi)源性抗菌肽，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[4]。人β-防御素3(hβD-3)被認(rèn)為是最具有潛力的防御素類抗菌肽，可有效抵抗牙周支持組織的病菌[5]。但hβD-3在機(jī)體內(nèi)含量很少，且很難在體外大量合成。研究[6]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用基因工程技術(shù)可以大量生成hβD-3。人脂肪干細(xì)胞(hADSCs)是具有多向分化潛能的干細(xì)胞，易獲取、易培養(yǎng)，增殖速度快，已被安全有效地應(yīng)用在退行性骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病及其并發(fā)癥和創(chuàng)傷修復(fù)等的治療中，其可在基因工程中用于治療牙周骨缺損[7]。有報(bào)道應(yīng)用重組腺相關(guān)病毒和慢病毒為載體成功介導(dǎo)人滑膜間質(zhì)干細(xì)胞及軟骨細(xì)胞，并通過動(dòng)物模型驗(yàn)證。因此，本研究采用慢病毒介導(dǎo)hβD-3基因轉(zhuǎn)染hADSCs, 探討hβD-3轉(zhuǎn)染hADSCs成骨分化潛能及體外抗牙周炎致病菌的作用，以期尋找治療難治性牙周炎牙周骨缺損的新方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司), hADSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基[賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司], 0.02% 乙二胺四乙酸(EDTA)+0.25%胰酶(美國(guó)Gibco公司)，I型膠原酶(上?；鄯f生物科技有限公司), MH瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司), BHI瓊脂培養(yǎng)基(上海邦景實(shí)業(yè)有限公司)，RNA提取試劑盒和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega Corporation公司), SYBR Green RT-PCR 試劑盒(日本TaKaRa公司), MA-6000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(蘇州雅睿生物技術(shù)有限公司), MB-530酶標(biāo)儀(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司), CytoFLEX LX流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman-Coulter公司), CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審批且志愿者知情同意。在對(duì)志愿者行吸脂術(shù)時(shí)，用無菌管提取腹部脂肪組織20 mL左右，加入同等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗，剪碎組織后1 h內(nèi)移入離心管，加入0.075%的Ⅰ型膠原酶，震蕩消化后加入DMEM培養(yǎng)基終止消化，以800轉(zhuǎn)/min離心10 min, 采用差異貼壁法從成熟脂肪細(xì)胞、血細(xì)胞中分離hADSCs, 細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，每隔3 d進(jìn)行換液，待細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶底部的90%左右后進(jìn)行傳代，取第3代細(xì)胞觀察細(xì)胞形態(tài)，并用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞免疫表型(CD29/CD44)進(jìn)行鑒定。

1.3 hβD-3基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染hADSCs

取第3代hADSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，引物設(shè)計(jì): 利用SGD軟件設(shè)計(jì)引物, 5′端序列為5′-CTAGCTAGCCAAATCCATAGGG-AGCTCTG-3′; GCTAGC為限制性內(nèi)切酶Nhel的酶切位點(diǎn), ATA為終止密碼子。3′端序列為5′-GGGTTTACC-GGTCATGTTTCAGGGTTTTTATT-3′; ACCGGT為限制性內(nèi)切酶Agel的酶切位點(diǎn), AGG為終止密碼子。重組質(zhì)粒構(gòu)建: 抽提hADSCs的總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法擴(kuò)增hβD-3至1.3 kb, 將Agel和Nhel從10 U/μL稀釋到1 U/μL, 將擴(kuò)增產(chǎn)物雙酶切，并于70 ℃下滅活10 min, 100 V電泳后從質(zhì)量濃度10 g/L瓊脂糖凝膠上的1.3 kb條帶處割膠，同時(shí)將已包含EGFP報(bào)告基因的pFUGW用Agel和Nhel雙酶切，將雙酶切后的載體和割下的膠帶按1∶3比例在16 ℃下反應(yīng)1 h, 期間加入T4 DNA, 即得到pFUGW-hβD-3重組質(zhì)粒。病毒包裝: 擴(kuò)增pFUGW-hβD-3后，將質(zhì)粒pMD2. G和psPAX2提純濃縮至1 μg/μL, 在雙蒸水中加入psPAX2 9 μg、pFUGW-hβD-3 31 μg、pMD2.G 10 μg, 總?cè)萘空{(diào)至1 600 μL。加入BES 1 750 μL和2.5 mol/L的氯化鈣(CaC12)150 μL, 混勻后室溫下放置20 min。逐滴將上述混合物加入含293T細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶保存于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中16 h, 棄上清，用0.45 μm濾紙過濾，將所得的病毒液(plentiV6-hβD-3)凍存于-80 ℃下備用。

1.4 增殖能力檢測(cè)

將細(xì)胞分為3組: 對(duì)照組、空載組與實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組不作處理，空載組轉(zhuǎn)染不含hβD-3基因的慢病毒載體，實(shí)驗(yàn)組利用質(zhì)粒構(gòu)建含hβD-3基因的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染hADSCs, 細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部的90%左右時(shí)，消化離心后，以細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，按50個(gè)/cm2密度接種于24孔板中，培養(yǎng)8 d, 每天分別取3孔，消化細(xì)胞后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值，繪制hADSCs生長(zhǎng)曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)。比較3組hADSCs的增殖能力。

1.5 分化能力檢測(cè)

對(duì)照組不作處理，空載組與實(shí)驗(yàn)組均加入成骨分化誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)7、14 d后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)3組細(xì)胞中成骨相關(guān)標(biāo)志物[堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ-型膠原蛋白(Col-Ⅰ)、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素(OCN)]的mRNA表達(dá)量，以評(píng)價(jià)hADSCs的分化能力。

方法如下: 用預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞，每孔加500 μL裂解液, 5 min后收集混懸液，保存于-20 ℃待檢，通過RNA提取試劑盒提取總RNA, 使用PrimeScipt RT試劑盒和莖環(huán)引物(5′-GTCGTATCAGCGAGGTATTCGTG-3′)對(duì)分離的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄; 通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)使用SYBR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR, 將反應(yīng)物在96孔板中于95 ℃擴(kuò)增5 min, 然后95 ℃10 s, 55.7 ℃ 30 s, 進(jìn)行40個(gè)循環(huán); 以GAPDH為內(nèi)參, 2-△△CT為目的基因相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度,ALP的正向引物序列為5′-TAGCGTAGTCCACCACTAAGGCC-3′, 反向引物序列為5′-GAGCTCTGATTACTACGTCAGTCG-3′,Col-Ⅰ的正向引物序列為5′-GCCTGAAGCTGCCAGTTGAAGTC-3′, 反向引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,OPN的正向引物序列為5′-CTAAGCATGCTACAATATTCGGTA-3′, 反向引物序列為5′-AGGCCTTGATGCCGTTAGCT-3′,OCN的正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′, 反向引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,GAPDH的正向引物序列為5′-GTGCTAGAGCTCGTGATTCGCGTC-3′, 反向引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.6 體外抑菌能力檢測(cè)

采用瓊脂彌散抑菌圈的方法進(jìn)行樣品測(cè)定。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的葡萄球菌、卟啉單胞菌分別均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基平板、BHI瓊脂平板上，并將卟啉單胞菌BHI瓊脂平板倒置在恒溫(37 ℃)厭氧箱中進(jìn)行為期72 h的厭氧培養(yǎng)。待菌液充分吸收后，利用直徑為3 mm的打孔器均勻打孔。將純化后的實(shí)驗(yàn)組hβD-3-hADSCs按不同密度(10個(gè)/cm2、100個(gè)/cm2、1 000個(gè)/cm2)接種于培養(yǎng)基孔中，分別記為低密度組、中密度組、高密度組，對(duì)照組與空載組的hADSCs以密度1 000個(gè)/cm2接種于培養(yǎng)基孔中, 37 ℃孵育過夜。利用電子數(shù)顯卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，重復(fù)5次，取平均值，另設(shè)置抗生素陽性對(duì)照組，抗生素陽性對(duì)照組分別為米諾環(huán)素組(30 μg)、環(huán)丙沙星組(5 μg)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 hADSCs的鏡下觀察及表面抗原表達(dá)

顯微鏡下觀察原代及第3代hADSCs, 原代細(xì)胞培養(yǎng)2 d即可觀察到細(xì)胞貼壁，大多為梭形，有少量的星形或分叉形細(xì)胞(圖1A); 細(xì)胞培養(yǎng)傳至P3代時(shí)，可觀察到細(xì)胞呈漩渦狀排列，幾乎全呈長(zhǎng)梭形(圖1B)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示, hADSCs的表面標(biāo)記物CD29、CD44均呈強(qiáng)陽性，陽性率為92.4%、90.0%, 符合干細(xì)胞的表面抗原表達(dá)，表明hADSCs純度較高，見圖1C、圖1D。

A: 原代hADSCs(放大100倍); B: 第3代hADSCs(放大100倍); C: CD29表達(dá); D: CD44表達(dá)。圖1 hADSCs的鏡下觀察及表面抗原表達(dá)

2.2 增殖能力檢測(cè)

3組hADSCs生長(zhǎng)曲線均呈現(xiàn)出“S”形，培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí), 3組細(xì)胞數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 誘導(dǎo)7 d后形態(tài)學(xué)觀察

誘導(dǎo)7 d后，對(duì)照組細(xì)胞仍呈長(zhǎng)梭形，空載組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核變大，形態(tài)開始變寬大扁平，有向多角形變化的趨勢(shì)。見圖3。

A: 對(duì)照組; B: 實(shí)驗(yàn)組; C: 空載組。圖3 細(xì)胞誘導(dǎo)7 d后形態(tài)學(xué)觀察

2.4 ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN mRNA相對(duì)表達(dá)量

誘導(dǎo)7、14 d時(shí)，空載組與實(shí)驗(yàn)組的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCNmRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 空載組與實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)14 d時(shí)的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCNmRNA相對(duì)表達(dá)量高于誘導(dǎo)7 d時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

A: ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量; B: Col-Ⅰ mRNA相對(duì)表達(dá)量; C: OPN mRNA相對(duì)表達(dá)量; D: OCN mRNA相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與誘導(dǎo)7 d時(shí)比較, #P<0.05。圖4 ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.5 體外抑菌能力檢測(cè)

葡萄球菌抑菌實(shí)驗(yàn)中，低密度組抑菌圈小于米諾環(huán)素組與環(huán)丙沙星組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.120,P<0.001;t=6.149,P<0.001); 中密度組抑菌圈大于環(huán)丙沙星組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.250,P<0.001), 與米諾環(huán)素組抑菌圈比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.857,P=0.416); 高密度組抑菌圈大于米諾環(huán)素組與環(huán)丙沙星組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.061,P<0.001;t=15.233,P<0.001)。卟啉單胞菌抑菌實(shí)驗(yàn)中，低密度組抑菌圈小于米諾環(huán)素組與環(huán)丙沙星組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.768,P<0.001;t=15.765,P<0.001); 中密度組抑菌圈大于米諾環(huán)素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.216,P<0.001), 與環(huán)丙沙星組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.158,P=0.250); 高密度組抑菌圈大于米諾環(huán)素組與環(huán)丙沙星組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.457,P<0.001;t=10.256,P<0.001)。見表1。

表1 各組抑菌圈直徑比較 mm

3 討 論

牙周炎由牙菌斑中細(xì)菌侵犯牙周引起，好發(fā)于35歲以上的成年人群，男性發(fā)病率高于女性[8]。難治性牙周病指由某些特異性微生物引起的感染，治療成功率較低，可導(dǎo)致患者牙齒缺損，嚴(yán)重影響患者正常工作和生活[9]。因此，尋找安全有效的治療方法具有重要的意義。β-防御素是一類富含二硫鍵的陽離子型多肽，是動(dòng)物黏膜組織抵御外界病原微生物侵襲的第一道化學(xué)屏障，是生物免疫系統(tǒng)中的重要調(diào)節(jié)分子[10]。在β-防御素家族中, hβD-3對(duì)金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌、革蘭陰性菌以及酵母、白色念珠菌都具有強(qiáng)烈的殺傷作用，且在生理鹽水中活性不受影響，其對(duì)福賽氏類桿菌、齒密螺旋體、牙齦卟啉單胞菌、牙齦卟啉菌等的殺傷能力遠(yuǎn)大于其他種類防御素[11]，故可采用hβD-3治療難治性牙周病。但hβD-3很難在體內(nèi)大量生成，因此，尋找體外大量生成hβD-3的方法極為關(guān)鍵。

近年來，干細(xì)胞治療牙周骨缺損的可能性被提出, hADSCs取材簡(jiǎn)便、來源豐富、易于培養(yǎng)，對(duì)機(jī)體損傷小，且具有多向分化潛能[12-13]。因此本研究選用脂肪干細(xì)胞作為種子細(xì)胞。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顯微鏡下原代細(xì)胞培養(yǎng)2 d即可觀察到細(xì)胞貼壁，大多為梭形，有少量的星形或分叉形細(xì)胞; 細(xì)胞培養(yǎng)傳至P3代時(shí)，可觀察到細(xì)胞呈漩渦狀排列，幾乎全呈長(zhǎng)梭形，符合干細(xì)胞形態(tài)學(xué)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示, hADSCs的表面標(biāo)記物CD29、CD44均呈強(qiáng)陽性，陽性率為92.4%、90.0%, 符合干細(xì)胞的表面抗原表達(dá)，表明hADSCs純度較高。3組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均呈現(xiàn)出“S”形，符合細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律，且在7～8 d保持穩(wěn)定，提示轉(zhuǎn)染后的hADSCs并未無限制生長(zhǎng)。

本研究結(jié)果還顯示，誘導(dǎo)7 d后，對(duì)照組細(xì)胞仍呈長(zhǎng)梭形，空載組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核變大，形態(tài)開始變寬大扁平，有向多角形變化的趨勢(shì)。誘導(dǎo)7、14 d時(shí)，空載組與實(shí)驗(yàn)組的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCNmRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，空載組與實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)14 d時(shí)的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCNmRNA相對(duì)表達(dá)量高于誘導(dǎo)7 d時(shí)，提示轉(zhuǎn)染后的hADSCs具有成骨分化的潛能。轉(zhuǎn)染后的hADSCs可直接向成骨方向分化，以促進(jìn)骨折愈合及加速骨缺損修復(fù)，有助于治療牙周缺損。在葡萄球菌、卟啉單胞菌抑菌實(shí)驗(yàn)中，高密度組抑菌圈均大于米諾環(huán)素組與環(huán)丙沙星組，提示轉(zhuǎn)染后的hADSCs可穩(wěn)定表達(dá)hβD-3, 且具有一定的抗菌性。分析原因可能是，慢病毒載體介導(dǎo)的hβD-3基因轉(zhuǎn)染可整合入宿主染色體，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定持久表達(dá)。hβD-3表達(dá)后分子帶正電荷可利用靜電作用與帶負(fù)電荷的細(xì)菌胞膜結(jié)合，疏水區(qū)形成多個(gè)通道，破壞胞膜造成胞外的離子等流入胞內(nèi)，胞內(nèi)重要成分外流，最終致使細(xì)菌死亡。研究[14]發(fā)現(xiàn),hβD-3基因轉(zhuǎn)染處理大鼠牙周膜細(xì)胞，可降低牙周炎大鼠組織破壞，減輕牙周組織炎癥。另一研究[15]發(fā)現(xiàn)，慢病毒轉(zhuǎn)染人β-防御素后，可顯著抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的促炎因子表達(dá)，亦可抑制牙周炎主要致病微生物的增殖。

綜上所述，經(jīng)hβD-3基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染hADSCs, 細(xì)胞可正常傳代生長(zhǎng)，誘導(dǎo)成骨分化，轉(zhuǎn)染后的hADSCs對(duì)葡萄球菌、卟啉單胞菌均有較好的抗菌活性，抑菌圈隨著細(xì)胞濃度升高而增大，可為治療難治性牙周病提供新的治療手段。