人胎腦來源神經(jīng)干細(xì)胞移植后的致瘤性研究

尹玉柱 梁久紅

干細(xì)胞是一類具有長期（或無限）自我更新、增殖及多向分化潛能，能產(chǎn)生某種（或多種）特殊功能細(xì)胞的原始細(xì)胞，它是生命起源、組織器官發(fā)育和損失后再生修復(fù)的基礎(chǔ)，具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。自1951年至今，干細(xì)胞研究在血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤、糖尿病、腸炎、代謝性疾病、肝病、急重癥感染以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面取得了一定成果[1～9]，但在腦、脊髓等神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面進(jìn)展比較緩慢，可能與人神經(jīng)干細(xì)胞獲得、提存、培養(yǎng)、擴(kuò)增及應(yīng)用途徑和安全系數(shù)等有關(guān)。神經(jīng)系統(tǒng)（尤其是中樞神經(jīng)）損傷和退化，最終要由神經(jīng)干細(xì)胞來解決。有研究用人類胚胎干細(xì)胞來源的少突先驅(qū)膠質(zhì)細(xì)胞治療頸脊髓損傷大鼠，注入該細(xì)胞1周后，大鼠的運(yùn)動(dòng)能力恢復(fù)至正常大鼠的97%[10]；2017年國內(nèi)學(xué)者開展了人胚胎干細(xì)胞來源的神經(jīng)前體細(xì)胞治療帕金森病、人胚胎干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞治療干性年齡相關(guān)性黃斑變性的臨床研究[11]。上述研究均未采取直接移植人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞，因有證據(jù)顯示人胚胎干細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)能夠形成畸胎瘤[12]。異體人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞（即來源于新鮮棄胎的胎腦神經(jīng)組織）移植后是否有致瘤性、是否會(huì)發(fā)生異體免疫排斥反應(yīng)等問題仍未明確。本研究探討移植原代人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞后是否具有致瘤性，以期為其下一步臨床試驗(yàn)和應(yīng)用的安全性及可行性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與器材

1.1.1 細(xì)胞系 來自于人胚胎發(fā)育早期階段的原代胎腦神經(jīng)干細(xì)胞由吉林大學(xué)通源生物工程有限公司提供，細(xì)胞劑量1×108個(gè)/ml。Hela細(xì)胞由華東師范大學(xué)生命醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡的免疫缺陷小鼠BALB/c，來源于華東師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)前常規(guī)適應(yīng)飼養(yǎng)1d。

1.1.3 主要試劑及器材 杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）購自Gibco公司，HE染色試劑盒（Giemsa）、0.9%氯化鈉注射液購自上海百特醫(yī)療用品有限公司，恒溫箱（江蘇恒創(chuàng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），流式細(xì)胞儀（BD公司，BD FACSCaliburTM Flow Cytometer）。

1.2 試驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)分為3組：實(shí)驗(yàn)組、Hela細(xì)胞陽性對(duì)照組及DPBS陰性對(duì)照組，每組20只小鼠（雌雄各10只）；注射方式為肋部皮下單次注射，注射體積為0.2ml/只，實(shí)驗(yàn)組注射原代人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞2×107個(gè)/只，Hela細(xì)胞陽性對(duì)照組注射Hela細(xì)胞1×106個(gè)/只，DPBS陰性對(duì)照組注射DPBS 0.2ml/只。每天觀察小鼠行為活動(dòng)、腺體分泌、糞便形態(tài)及體表粘膜等一般生理指標(biāo)并記錄。于注射后第1、2、3、6個(gè)月對(duì)部分小鼠注射部位進(jìn)行病理切片檢查（HE染色），每次每組隨機(jī)解剖5只，以確定其是否發(fā)生瘤變，記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀態(tài)觀察 在注射后6個(gè)月內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和DPBS陰性對(duì)照組小鼠精神及行為活動(dòng)、腺體分泌、糞便形態(tài)、體表粘膜等均無明顯變化；Hela細(xì)胞陽性對(duì)照組小鼠在注射Hela細(xì)胞1個(gè)月左右陸續(xù)出現(xiàn)精神較差、行動(dòng)遲緩、糞便成黃褐色伴不成形等，個(gè)別小鼠眼睛有眼屎。

2.2 小鼠注射部位觀察、病理切片及HE染色 通過注射后6個(gè)月的觀察，實(shí)驗(yàn)組與DPBS陰性對(duì)照組小鼠肋部皮下注射點(diǎn)位置均無腫塊或瘤體形成；Hela細(xì)胞陽性對(duì)照組所有小鼠在注射后2周左右肋部皮下注射點(diǎn)部位逐漸有瘤體形成，1個(gè)月左右在注射部位有明顯的瘤塊形成，2個(gè)月后注射部位可見1～1.2cm3的瘤組織生成。將注射后2個(gè)月的小鼠處死，取注射部位組織進(jìn)行病理切片和HE染色（見圖1），DPBS陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均呈現(xiàn)正常皮膚組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，胞體豐富、束狀排列；而Hela細(xì)胞陽性對(duì)照組則呈現(xiàn)典型的瘤組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞致密、無規(guī)則排列。第3個(gè)月、第6個(gè)月的病理切片和HE染色結(jié)果與第2個(gè)月相同。

圖1 注射后2個(gè)月小鼠注射部位病理切片

2.3 小鼠注射部位瘤變情況比較 與注射前相比，在注射后6個(gè)月內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和DPBS陰性對(duì)照組小鼠一般狀態(tài)的變化率為0，注射部位成瘤/成腫塊率為0；Hela細(xì)胞陽性對(duì)照組小鼠一般狀態(tài)的病態(tài)變化率為100%，注射部位成瘤率為100%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3 討論

人類是多細(xì)胞物種，人體由數(shù)以百萬億計(jì)的細(xì)胞構(gòu)成。人體的所有行為活動(dòng)、生理狀態(tài)以及病理變化，都是細(xì)胞狀態(tài)和功能變化的具體體現(xiàn)。疾病是某些細(xì)胞衰老、病變的綜合反應(yīng)。人類細(xì)胞是有壽命的，是有限資源，所以人體要經(jīng)過生老病死過程，而這個(gè)過程是由自體先天性固有干細(xì)胞資源決定的。細(xì)胞包括干細(xì)胞和終末分化的各種功能細(xì)胞，所有細(xì)胞都來源于干細(xì)胞。干細(xì)胞是人體生長發(fā)育、維持新老細(xì)胞穩(wěn)態(tài)更新以及組織/器官再生、修復(fù)的基礎(chǔ)，但人類干細(xì)胞的壽命也是有限的，遵循增齡、增代性衰減的自然規(guī)律，所以，補(bǔ)充（即移植）異體干細(xì)胞無疑是防治疾病、抗衰、延長生命的一種可期選擇。神經(jīng)干細(xì)胞更是如此，人體出生時(shí)為神經(jīng)系統(tǒng)（尤其是腦、脊髓等中樞神經(jīng)）預(yù)留的干細(xì)胞極其有限，這是導(dǎo)致臨床上神經(jīng)系統(tǒng)疾病難以治愈的關(guān)鍵因素或根本原因。移植人異基因個(gè)體神經(jīng)干細(xì)胞，以補(bǔ)充其不足，提高神經(jīng)系統(tǒng)的再生修復(fù)能力，是從根源上防治神經(jīng)系統(tǒng)各種疾病的根本方法。但其最大障礙是移植干細(xì)胞的致瘤性，以及與受體之間的免疫排斥反應(yīng)問題。之前已有成體神經(jīng)干細(xì)胞致瘤性的相關(guān)研究[13，14]，但其取材、傳代、擴(kuò)增以及應(yīng)用等明顯受限；本研究以人胎腦來源的原代神經(jīng)干細(xì)胞（即胚胎神經(jīng)干細(xì)胞）為研究對(duì)象，探討其移植后的致瘤性，從而為解決可臨床應(yīng)用的人神經(jīng)干細(xì)胞資源匱乏，預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄓ绕涫切耗X癱，神經(jīng)損傷，腦/脊髓增齡性、退行性改變等）提供新思路。

可用于移植的不同來源人神經(jīng)干細(xì)胞各具優(yōu)缺點(diǎn)：①自體干細(xì)胞：屬于成體神經(jīng)干細(xì)胞范疇，優(yōu)點(diǎn)是無免疫排斥反應(yīng)；缺點(diǎn)是呈增齡、增代性功能老化的生物學(xué)特性，而非神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成可用的神經(jīng)干細(xì)胞難度極大。②誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs），屬于人工重編輯的干細(xì)胞，無倫理道德問題，不需要HLA配型，但有成活性低、有效性和可控性不確定、有致瘤性和脫靶性等風(fēng)險(xiǎn)。③異基因/異體神經(jīng)干細(xì)胞：成體神經(jīng)干細(xì)胞，包括成人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞、傳數(shù)代后的干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的功能細(xì)胞、體外誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)分化的神經(jīng)干細(xì)胞等，其取材、傳代、擴(kuò)增以及時(shí)效性等方面明顯受限，需要HLA配型，否則移植后易發(fā)生異基因免疫排斥反應(yīng)等問題，風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)高。人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞，來源于孕4～12周、其父母已經(jīng)放棄、非病理性流產(chǎn)的新鮮棄胎，吉林大學(xué)通源生物工程有限公司通過獨(dú)特的干細(xì)胞分離純化、培養(yǎng)、鑒定等技術(shù)獲取，經(jīng)免疫學(xué)、微生物學(xué)以及分子生物學(xué)等檢測合格，具有自我更新、增殖能力強(qiáng)以及極低免疫原性等生物學(xué)特性，移植可不需嚴(yán)格的HLA配型。本研究選用的是原代干細(xì)胞，免去了因培養(yǎng)、傳代等可知或不可知因素的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更趨客觀、真實(shí)。結(jié)果顯示：Hela細(xì)胞陽性對(duì)照組具有顯著的成瘤性，而實(shí)驗(yàn)組移植的人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞與DPBS陰性對(duì)照組結(jié)果一致，無致瘤/成瘤性。人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞的移植與應(yīng)用比較安全，有較強(qiáng)的可行性，但其作用機(jī)制尚不明確，可能為：①通過細(xì)胞間接觸調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，或分泌可溶性細(xì)胞因子、SC-EVs等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制功能[15～17]；②通過分泌細(xì)胞因子、外泌體或細(xì)胞間接觸，調(diào)節(jié)和激活受體自身的休眠干細(xì)胞及（或）老代干細(xì)胞，增殖、分化產(chǎn)生新功能細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞更新、組織再生與修復(fù)；③通過干細(xì)胞替代機(jī)制，即人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞因免疫原性極低、免疫耐受而存活，并能夠如同受體自體干細(xì)胞一樣進(jìn)行自我復(fù)制、增殖、分化，產(chǎn)生相應(yīng)的健康功能細(xì)胞，以補(bǔ)充和更新替換衰老、病變細(xì)胞，恢復(fù)或重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

綜上所述，人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞可能參與和提升受體神經(jīng)組織的穩(wěn)態(tài)更新、再生修復(fù)過程，有望解決臨床及科研中人神經(jīng)干細(xì)胞資源匱乏等難題。但也有因?qū)嶒?yàn)裸鼠數(shù)量不足以及選取的人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育階段不同等因素而出現(xiàn)致瘤風(fēng)險(xiǎn)的可能，之后我們將進(jìn)行人胎腦來源神經(jīng)干細(xì)胞致瘤性的分子遺傳學(xué)研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，人胚胎干細(xì)胞的倫理道德和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)等問題亦亟待解決。