高子晴 崔彤霞
Klotho是近年發(fā)現(xiàn)的一種與衰老相關的蛋白,其主要在腎小管上皮細胞中表達。研究發(fā)現(xiàn),不同原因引起的慢性腎臟?。–hronic kidney disease,CKD)均可導致Klotho表達下調(diào),Klotho缺乏是CKD的早期表現(xiàn),同時也加速CKD的進展[1]?,F(xiàn)已證實甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)是慢性腎臟病患者體內(nèi)的重要毒素之一,可引起軟組織及心血管鈣化等全身多系統(tǒng)損害,而Klotho可抑制AngⅡ的激活,減緩CKD的進程[2],并可以增加血磷的排泄,進一步減少PTH的生成[3,4]。Strutz等[5]首次提出腎小管上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腎臟纖維化的重要因素之一,標志著CKD的結(jié)局,表現(xiàn)為上皮細胞在轉(zhuǎn)分化的過程中失去上皮細胞標志物(如E-cadherin),獲得間充質(zhì)細胞標志物(如α-SMA)的高表達。近年研究證實,Rho/Rock信號通路是導致CKD腎臟纖維化的重要信號通路之一[6]。法舒地爾(Fasudil)是體內(nèi)或體外實驗使用最為普遍的Rho/Rock信號通路抑制劑,為研究用法舒地爾抑制或減輕PTH誘導的CKD提供了理論依據(jù)[7],但是否可以通過提高Klotho的表達來減輕PTH引起的EMT尚未見報道。本研究擬觀察不同濃度法舒地爾對PTH誘導的人腎小管上皮細胞EMT中Klotho表達的影響,以探討Klotho及法舒地爾在慢性腎臟病過程中的作用。
1.1 主要材料 人腎小管上皮細胞HK-2(美國ATCC,CRL-2190TM);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國Gibco);上皮細胞生長因子(美國Peprotech);法舒地爾注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司,規(guī)格30mg/2ml);PTH 1-34(美國Sigma);α-SMA抗體、E-cadherin抗體、Klotho抗體(美國Santa),PBS溶液(美國Gibco),定量PCR試劑盒(瑞士Roche),Total RNA提取試劑(美國Invitrogen Life Technologies),BCA蛋白定量檢測試劑盒(美國Bio-rad);Actin(美國CST)。
1.2 實驗分組 原代腎小管上皮細胞在上皮細胞培養(yǎng)基(胎牛血清10ml,上皮細胞生長因子1ml,青霉素/鏈霉素1ml,加入88ml基礎培養(yǎng)基中)培養(yǎng)下傳代,取第3代上皮細胞用于實驗,實驗分為5組,分別為:空白對照組(C組):腎小管上皮細胞不作任何處理;T1組:PTH(10-10mol/L)+法舒地爾(0μmol/L);T2組:PTH(10-10mol/L)+法舒地爾(10μmol/L);T3組:PTH(10-10mol/L)+法舒地爾(20μmol/L);T4組:PTH(10-10mol/L)+法舒地爾(30μmol/L)。培養(yǎng)時間為48h。
1.3 實驗方法
1.3.1 Western-blot檢測Klotho蛋白的表達 培養(yǎng)48h后,用TBS緩沖鹽水沖洗腎小管上皮細胞3次,在培養(yǎng)皿中加入RIPA裂解緩沖液,通過反復搖動使試劑與細胞充分混合,用細胞刮刀將細胞刮下來并收集。細胞裂解液(30μg)在12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳并將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,與驢抗鼠抗體(0.2μg/ml)、驢抗兔抗體(0.2μg/ml)作為內(nèi)部對照進行雜交,然后用1μg/ml抗驢免疫球蛋白G-過氧化物結(jié)合物對條帶進行掃描測量其強度,使用數(shù)字凝膠電泳圖像處理和分析系統(tǒng)進行檢測。
1.3.2 RT-PCR檢測E-cadherin、α-SMA及Klotho mRNA表達 培養(yǎng)48h后,用Trizol試劑從腎小管上皮細胞分離出總RNA。進行RT-PCR分析,用反轉(zhuǎn)錄酶和oligo dT引物從1μg總RNA中合成cDNA,體積為10μl,用Tris/EDTA緩沖液將反應混合物調(diào)整為50μl,用于PCR分析。cDNA擴增反應混合物最初在95℃溫育30s以使DNA變性;擴增進行40個循環(huán),95℃5s,60℃34s。RTPCR在以下條件下進行,95℃2min,然后進行40個循環(huán),95℃35s,60℃1min,72℃2min,通過熔解曲線分析,用肌動蛋白作為內(nèi)源性控制基因?qū)?shù)據(jù)進行處理。使用引物:E-cadherin:上游5'-CCGGGACAACGTTTATTACTAT-3',下游5'-CATA GTCAAACACGAGCAGAGAAT-3';α-SMA:上游5'-CTTGAGAAGAGTTACGAGTTGC-3',下 游5'-GATGCT GTTGTAGGTGGTTTC-3';Klotho:上游5'-ACAATACT TCTTTCCGTCCCACT-3',下游5'-GAGCAAAAAAGTC AGCAGTTCCT-3';Actin:上游5'-CACCCAGCACAAT GAAGATCAAGAT-3',下游5'-CCAGTTTTTAAATCCT GAGTCAAGC-3'。根據(jù)2-△△Ct方法計算相對表達率。
1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,多個樣本均數(shù)兩兩之間比較采用LST-t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 細胞形態(tài)學改變 倒置顯微鏡下觀察,正常腎小管上皮細胞呈圓形或類圓形,排列如鋪路石樣,經(jīng)PTH刺激后不同程度地拉長,變?yōu)殚L梭形或不規(guī)則形,胞間連接變松散,排列呈索條狀。外源性給予法舒地爾后,上皮細胞發(fā)生EMT的細胞數(shù)量減少,見圖1。
圖1 細胞形態(tài)學改變
2.2 Western-blot檢測結(jié)果 T1組在PTH的刺激下Klotho蛋白表達明顯減少;而在法舒地爾干預下,T2~T4組Klotho蛋白表達明顯增多,并且隨著法舒地爾的濃度增高,Klotho蛋白水平逐漸升高,T3組達到峰值,T4組與T3組相比稍有下降,見圖2。
圖2 各組Klotho蛋白的表達
2.3 RT-PCR檢測結(jié)果 T1組在PTH刺激下Klotho mRNA表達明顯減少。而在法舒地爾的干預下,與T1組相比T2~T4組Klotho mRNA表達明顯增強(P<0.05),并且隨著法舒地爾的濃度增高,Klotho mRNA表達水平逐漸升高,T3組達到峰值,T4組稍有下降,但與T3組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與C組相比,T1~T4組E-cadhernin mRNA表達明顯下降,α-SMA mRNA表達明顯增加,尤其以T1組最為顯著(P<0.05)。在T1~T3組,隨著法舒地爾濃度增高,E-cadhernin mRNA表達量逐漸上升,α-SMA mRNA表達量逐漸下降,T3組達到峰值,T4組稍有所下降,但T3、T4組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),各組與T1組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。
表1 各組E-cadherin、α-SMA、Klotho mRNA水平比較(±s)
表1 各組E-cadherin、α-SMA、Klotho mRNA水平比較(±s)
注:與T1組比較,*P<0.05;與C組比較,ΔP<0.05
項目 C 組 T1組 T2組 T3組 T4組α-SMA mRNA 0.901±0.015* 2.278±0.116Δ 1.811±0.364*Δ 1.300±0.083*Δ 1.402±0.127*Δ E-cadherin mRNA 1.493±0.011* 0.295±0.007Δ 0.824±0.032*Δ 1.186±0.097*Δ 1.092±0.027*Δ Klotho mRNA 1.207±0.029* 0.362±0.016Δ 0.882±0.101*Δ 1.291±0.091*Δ 1.212±0.038*Δ
腎小管EMT是腎臟成纖維細胞的主要來源,在腎臟纖維化的發(fā)生與進展中起著重要作用,其中PTH是促進EMT的重要細胞因子。Klotho蛋白是近年研究發(fā)現(xiàn)的一種與衰老相關的蛋白,其主要在腎小管上皮細胞中表達。有研究表明,在腎臟損傷情況下,Klotho蛋白表達下調(diào),而該蛋白表達下調(diào)促進了腎臟損傷,導致Klotho蛋白進一步下降,通過提高內(nèi)源性Klotho蛋白表達或增加外源性Klotho蛋白可緩解及阻止腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展,說明Klotho蛋白不僅是早期腎損傷的標記物,更是保護因子[8,9]。法舒地爾是唯一用于臨床的Rho/Rock信號通路選擇性抑制劑[10],可以減少蛋白尿和腎小球系膜外基質(zhì)堆積,減輕腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化等[11~13]。基于此,本實驗研究Rho/Rock信號通路抑制劑法舒地爾對PTH誘導人腎小管上皮細胞EMT中Klotho蛋白表達的影響,可能有助于尋找防治腎臟纖維化的新靶點。
本研究在倒置顯微鏡下觀察正常腎小管上皮細胞形態(tài),呈圓形或類圓形,排列如鋪路石樣,不雜亂;而加入PTH后,腎小管上皮細胞呈不同程度的拉長,變?yōu)殚L梭形或不規(guī)則形,胞間連接變松散,排列呈索條狀,呈典型的纖維樣改變。在法舒地爾的干預下,發(fā)生形態(tài)改變的細胞數(shù)量明顯減少,EMT明顯減輕。說明PTH可以誘導EMT,而外源性給予法舒地爾可明顯減輕纖維化程度,減少腎小管上皮細胞損傷,進一步延緩CKD進程。
通過Western-blot和RT-PCR檢測Klotho蛋白和mRNA的表達結(jié)果顯示,T1組在PTH刺激下Klotho mRNA和蛋白表達明顯減少,而在法舒地爾的干預下,T2~T4組Klotho mRNA和蛋白表達明顯增強,并且隨著法舒地爾的濃度增高,Klotho mRNA和蛋白水平逐漸升高,其中法舒地爾在20μmol/L時作用最顯著,并且T3、T4組Klotho mRNA表達水平均高于C組,說明在PTH誘導的腎小管上皮細胞EMT過程中,腎小管上皮細胞內(nèi)源性Klotho表達明顯減少,而在Rho/Rock信號通路抑制劑法舒地爾的干預下,腎小管上皮細胞EMT程度減輕,并可同時誘導人腎小管上皮細胞內(nèi)源性Klotho表達增高,更進一步減輕EMT。隨著Klotho的表達增加,上皮細胞標志物E-cadherin表達上調(diào),間充質(zhì)細胞標志物α-SMA表達下調(diào),標志著EMT程度減輕,也從另一個角度說明在法舒地爾的干預下,上調(diào)Klotho的表達可減緩EMT的發(fā)生、發(fā)展。提示Klotho在腎臟纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的保護作用。但是關于Klotho的傳導通路、對腎臟的具體保護作用機制及PTH、Rho/Rock信號通路誘導EMT的機制等尚需進一步研究。
綜上所述,法舒地爾在PTH誘導的人腎小管上皮細胞EMT中,可能通過上調(diào)Klotho表達減緩EMT的發(fā)展。