不同抗凍保護(hù)劑對綿羊精液冷凍保存效果的影響

郝冠英，劉宏濤，王晶晶，白佳琛，劉昱成，石國慶，趙學(xué)明，萬鵬程*

（1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000；3.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

精液冷凍保存技術(shù)是指精液儲(chǔ)存在超低溫條件下，當(dāng)回到正常的生理溫度（37℃）時(shí)可以繼續(xù)發(fā)育的一項(xiàng)輔助生殖技術(shù)。精液冷凍保存技術(shù)在畜牧生產(chǎn)上對提高優(yōu)良種公畜利用率、優(yōu)良遺傳資源的保存利用、配子低溫生物保存技術(shù)的研究，以及人類輔助生殖技術(shù)的發(fā)展都具有十分重要的意義［1］。

目前廣泛使用的精液保存方法有低溫液態(tài)保存和超低溫冷凍保存兩種［2］。1937年最早報(bào)道了綿羊精液冷凍保存［3］。在20世紀(jì)70年代綿羊精液冷凍方面的相關(guān)報(bào)道表明，綿羊精液冷凍后的受胎率為47.9%～57.4%［3］。隨著綿羊人工授精技術(shù)的普及和發(fā)展，到20世紀(jì)90年代，精液冷凍保存技術(shù)也獲得了長足的發(fā)展，利用凍精開展人工授精，母羊的受胎率達(dá)到60%［3］。

然而，由于家畜精液對外界條件的敏感性和不穩(wěn)定性，在一定程度上限制了家畜精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展。為提高家畜精液在冷凍-解凍后的活力和配種母畜受胎率，會(huì)在凍精稀釋液中添加冷凍保護(hù)劑、抗氧化劑、蛋白質(zhì)及無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分［4］。目前，精液質(zhì)量檢測常采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀檢測精子活力、活率、直線速率、曲線速率、運(yùn)動(dòng)軌跡等［5］。精液在冷凍過程中容易因低溫打擊形成冰晶，對精子細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)造成損傷［6］，因此普遍在稀釋液中添加抗凍保護(hù)劑，以降低精子的低溫?fù)p傷。其中，甘油（glycerinum，相對分子質(zhì)量為92.10）多年來被作為冷凍保護(hù)劑使用［7］，以相對分子質(zhì)量小、滲透性強(qiáng)為優(yōu)勢，但毒性較大。二甲基乙酰胺（DMA，相對分子質(zhì)量為59.07）相對分子質(zhì)量更小，滲透性更強(qiáng)［8］，更能滲透到精子內(nèi)部保護(hù)精子。本試驗(yàn)在綿羊精液冷凍保護(hù)劑中分別添加甘油、DMA及甘油+DMA，測定解凍后精子的活力、活率、直線速率、曲線速率、頂體完整率及DNA完整率等指標(biāo)，探究不同濃度抗凍保護(hù)劑對精液冷凍保存效果的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品的采集

中國美利奴羊（新疆軍墾型）公羊12只，平均年齡3歲，體格健壯，膘情較好，無生殖道疾病，生殖、營養(yǎng)、健康等方面狀況良好且個(gè)體之間無明顯差異，體型外貌和生產(chǎn)性能均符合種用標(biāo)準(zhǔn)。采用假陰道法采精，將采出的精液移入1.5 mL離心管中，放入37℃水浴。進(jìn)行常規(guī)檢測時(shí)，首先觀察顏色為乳白色或淺黃色，濃度在1×109/mL，射精量在0.5～1.0 mL，活力在0.8以上可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 主要試劑、藥品、儀器

卡蘇精液冷凍液（KS），購自IMV公司；丙二醇、DMA、Tris、青霉素、鏈霉素、吉姆薩染液，均購自Solarbio公司；檸檬酸、葡萄糖，均購自Wako公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒-FITC（100T），購自博士德公司。

綿羊精液冷凍稀釋基礎(chǔ)液［1.817 g Tris，0.25 g葡萄糖，0.995 g檸檬酸，7.5 mL卵黃，雙抗（慶大霉素和青霉素）100 000單位，加水至47.5 mL］，為自制。

精子冷凍儀（型號為CL-5500）、邁朗精子分析儀（CASA，型號為SJ-TMDI608）、邁朗一次性精子計(jì)數(shù)板（型號為ML-CASA 20）、酶標(biāo)儀（購自賽默飛公司）、水浴鍋（型號為HWS24，購自上海恒科宇公司），均來源于新疆農(nóng)墾科學(xué)院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）基礎(chǔ)液中添加甘油2.0%（G2組）、5.0%（G5組）、8.0%（G8組）；（2）基礎(chǔ)液中添加DMA 2.0%（D2組）、3.0%（D3組）、4.0%（D4組）、5.0%（D5組）；（3）基礎(chǔ)液中添加4.0%甘油+1.0% DMA（G4D1組），3.0%甘油+2.0%DMA（G3D2組），2.5%甘油+2.5%DMA（G2.5D2.5組），2.0%甘油+3.0%DMA（G2D3組）。為驗(yàn)證各試驗(yàn)組的效果，采用商品化的成熟綿羊凍精稀釋液作為對照組（KS組）判定各試驗(yàn)處理。將配制好的稀釋液用0.22μm濾器過濾混勻，4℃保存，備用。

1.4 試驗(yàn)步驟

1.4.1 精液冷凍前準(zhǔn)備工作 將采集的鏡檢活力在0.8以上、質(zhì)量合格的精子與稀釋液按1∶2的比例進(jìn)行稀釋，分組存放。

1.4.2 精液冷凍與解凍 精液冷凍：將稀釋的精液裝入0.25 mL細(xì)管，放入4℃冰箱內(nèi)平衡70 min。同時(shí)準(zhǔn)備精子冷凍儀，在5℃時(shí)放入細(xì)管，進(jìn)行程序化冷凍（即程序開始運(yùn)行，初始溫度在19.8～20.1℃；倒入液氮后運(yùn)行70 min左右到5℃；當(dāng)運(yùn)行75 min左右溫度在-10℃時(shí)溫度驟降，在90 min時(shí)降至-120℃），在90 min后溫度降至-120℃時(shí)冷凍完畢，將細(xì)管精液取出，投入液氮罐中保存。

精液解凍：從液氮中取出細(xì)管凍精，快速放入37℃水浴解凍30 s，擦拭干凈細(xì)管，剪開封口，將精液倒入1.5 mL離心管，按精液稀釋液體積比1∶1稀釋后混勻，利用計(jì)算機(jī)輔助精液分析儀檢測精子活力，精子密度≥2×109個(gè)/mL。

1.4.3 精液質(zhì)量檢測 解凍后精液孵育10 min，輕輕混勻，取10μL解凍后精子放置于精子分析儀專用載玻片上，利用邁郎精子分析儀檢測解凍后精子活力、活率、直線速率及曲線速率。其中活精子和死亡精子形態(tài)見圖1。

圖1 邁朗精液分析儀精液質(zhì)量檢測示意圖（20×）Fig 1 .Schematic diagram of semen quality detection of Milang semen analyzer（20×）

1.4.4 精子頂體完整率的檢測 采用吉姆薩染色法：吉姆薩染液按說明書進(jìn)行1∶10稀釋，常溫保存；取10μL解凍精液于載玻片涂片，等待10～15 min自然風(fēng)干；甲醛固定15 min，風(fēng)干后沖洗干凈，晾干；用吉姆薩染色液染色2 h，清水沖洗，風(fēng)干［9-10］。于油鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)視野（n≥200），重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)頂體完整的染成紫紅色的精子數(shù)和總精子數(shù)比例平均值，計(jì)算精子頂體完整率。其中頂體完整和破裂情況觀測見圖2。

圖2 吉姆薩染色的精子頂體形態(tài)（100×）Fig.2 Giemsa-stained sperm acrosome morphology（100×）

1.4.5 精子DNA完整率的檢測 使用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒-FITC：將玻片放入多聚賴氨酸溶液中30 min，至pH值為7.5；精液涂片，晾干，用4%多聚甲醛固定30～60 min；之后用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2 min并重復(fù)2次；用純水洗2 min并重復(fù)2次；配制標(biāo)記緩沖液，滴在玻片上20μL，放入濕盒中37℃保存2 h；用TBS洗2 min，重復(fù)3次；加封閉液50 μL，室溫濕盒保存30 min；用0.01 moL/L TBS洗2 min并重復(fù)3次，玻片上加50 μL；用SABC稀釋液，放入濕盒中37℃作用30 min；用0.01 moL/L TBS洗5 min，重復(fù)4次；DAPI染色5 min，再用純水洗2 min，重復(fù)2次；最后用抗熒光封片劑封片。在400×熒光顯微鏡波長520 nm下隨機(jī)選取4個(gè)視野（n≥200）觀察，精子呈現(xiàn)黃綠色熒光為死亡精子，計(jì)數(shù)活精子和死亡精子，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)精子DNA完整率。精子DNA完整情況判定見圖3。

圖3 精子DNA完整率（40×）Fig 3.Sperm DNA integrity（40×）

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”列出。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度甘油對綿羊凍精質(zhì)量的影響

G5組精子活力、活率、直線速率、曲線速率、頂體完整率、DNA完整率顯著高于其他甘油組（P＜0.05），但顯著低于KS組（P＜0.05），見表1。

表1 稀釋液中添加不同濃度甘油后綿羊凍精質(zhì)量測定結(jié)果Tab.1 Quality determination results of sheep frozen semen after adding different concentrations of glycerol in diluent %

2.2 不同濃度DMA對綿羊凍精質(zhì)量的影響

D3組精子活力、活率、直線速率、曲線速率、頂體完整率、DNA完整率顯著高于其他DMA組（P＜0.05），但顯著低于KS組（除曲線速率外，P＜0.05），見表2。

表2 稀釋液中添加不同濃度DMA后綿羊凍精質(zhì)量測定結(jié)果Tab.2 Quality determination results of sheep frozen semen after adding different concentrations of DMA into diluent %

2.3 甘油+DMA對綿羊凍精質(zhì)量的影響

為便于比較，將甘油組和DMA組中精子質(zhì)量最好的G5組數(shù)據(jù)與甘油+DMA組一起進(jìn)行分析。G3D2組精子活力、活率、頂體完整率、DNA完整率略高于G2.5D2.5組，但差異不顯著（P＞0.05），兩組均顯著高于G4D1、G2D3組（P＜0.05），顯著低于KS組（P＜0.05）；G3D2組直線速率顯著低于KS組和D5組（P＜0.05），顯著高于G4D1組、G2.5D2.5組和G2D3組（P＜0.05）；G3D2組曲線速率顯著低于G4D1組、G2.5D2.5組（P＜0.05），顯著高于G2D3組（P＜0.05），與KS組差異不顯著（P＞0.05）；G2.5D2.5組直線速率顯著低于KS組、G5組和G3D2組（P＜0.05），顯著高于G4D1組、G2D3組（P＜0.05），曲線速率與KS組差異不顯著（P＞0.05），見表3。

3 討論

3.1 不同濃度甘油對綿羊凍精質(zhì)量的影響

在稀釋液中，甘油是最常見的抗凍保護(hù)劑。劉晉津等［11］的研究表明，在豬精液抗凍保護(hù)劑中加入4%甘油時(shí)，冷凍-解凍后精子活力最佳。宋國欣等［12］的研究表明，在絨山羊精液抗凍保護(hù)劑中協(xié)同應(yīng)用海藻糖和甘油，添加1%～2%甘油時(shí)的DNA完整率較高，顯著高于不添加甘油組。本試驗(yàn)結(jié)果表明，綿羊精液冷凍保護(hù)劑中單獨(dú)添加甘油組中，添加5%甘油組的精子活力最高。李晟［13］報(bào)道，在公豬精液冷凍保護(hù)劑中添加3%甘油，精子解凍效果優(yōu)于添加5%DMA。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果有差異，分析原因：一是可能由于基礎(chǔ)液不同，導(dǎo)致結(jié)果不一致；二是可能由于動(dòng)物種類不一致導(dǎo)致。P.K.Jha等［14］研究表明，在公羊精液冷凍保護(hù)劑中添加5%甘油效果優(yōu)于添加7%甘油，與本試驗(yàn)結(jié)果（添加5%甘油效果優(yōu)于添加8%甘油）相近。

3.2 不同濃度DMA對綿羊凍精質(zhì)量的影響

據(jù)國內(nèi)外的研究報(bào)道，在雞［6］、豬［1-2］、牛［7］、鳥類［8］、魚類［9］、山羊［15］、綿羊［16］上使用DMA保存精液取得了較好的冷凍保護(hù)效果。乙酰胺類抗凍保護(hù)劑在所有滲透性和非滲透性抗凍保護(hù)劑中相對分子質(zhì)量最小、冷凍毒性最低［10］。研究山羊精液冷凍發(fā)現(xiàn)，添加5%DMA時(shí)可以減少活性氧（ROS）的形成和活性，改善精子的功能［15］。R.F.Bittencourt等［16］研究表明，在公羊精液冷凍保護(hù)劑中添加5%DMA或5%甘油的冷凍效果無明顯差異。A.Santiani等［17］發(fā)現(xiàn)，在秘魯帕索馬精液中添加3%～5% DMA時(shí)冷凍保護(hù)效果最佳。張偉［2］的研究表明，添加4%DMA時(shí)豬精液冷凍保存的精子活力、頂體完整率最高。郭堂玉等［18］的研究表明，1%DMA替代1%甘油用于公豬精液冷凍，解凍后精子活力更高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在綿羊精液冷凍保護(hù)劑中添加同為2%、5%DMA和甘油的冷凍效果有明顯差異，與前人研究結(jié)果有差異。分析原因：一是可能由于基礎(chǔ)液不同導(dǎo)致；二是可能由于動(dòng)物物種不同，精液內(nèi)含物不一致導(dǎo)致；三是由于DMA滲透性過大，抗凍保護(hù)成分大多流入精子內(nèi)部，致使精子外部沒有得到充分的保護(hù)，結(jié)晶過多導(dǎo)致死亡。

3.3 DMA與甘油聯(lián)合應(yīng)用對綿羊凍精質(zhì)量的影響

G.F.O Menezes等［19］研究表明，在公羊精液冷凍保護(hù)劑中添加3.0%甘油+3.0%DMA或4.0%甘油+2.0%DMA時(shí)冷凍保護(hù)效果較好。本試驗(yàn)中，在綿羊冷凍保護(hù)劑中添加3.0%甘油+2.0%DMA與2.5%甘油+2.5%DMA效果相當(dāng)，均好于其他聯(lián)合添加組。與G.F.O Menezes等［19］的研究結(jié)果接近。M.Anand等［20］的研究表明，冷凍-解凍后精子活力及運(yùn)動(dòng)性能檢測指數(shù)越高，其人工授精的受胎率越高。因此，可以通過測定冷凍-解凍精子活力與運(yùn)動(dòng)性能初步斷定精子品質(zhì)。精子不同于一般的體細(xì)胞，它是一種高度分化的單倍體雄性生殖細(xì)胞，具有獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生殖細(xì)胞特性［21］。頂體是呈帽狀形態(tài)的囊狀結(jié)構(gòu)，覆蓋在細(xì)胞核的前部，精子頂體完整性是判斷精子是否有受精能力的重要指標(biāo)。然而精子頂體極易因所處環(huán)境的變化而發(fā)生異常，精子頸部受損將會(huì)直接影響精子的運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致精液品質(zhì)降低。姜珊［22］的研究表明，精子頂體經(jīng)吉姆薩染色后可分為五種類型：頂體完整、頂體輕微膨脹、頂體膨脹、頂體部分脫落和頂體全部脫落。徐振軍等［23］研究表明，冷凍保存對綿羊精子DNA鏈的完整性沒有顯著影響。

本試驗(yàn)中添加3.0%甘油+2.0%DMA的DNA完整率顯著高于5%甘油組（P＜0.05），添加3.0%甘油+2.0%DMA的頂體完整率與單獨(dú)添加甘油相比差異不顯著（P＞0.05）。目前，甘油與DMA互作機(jī)制尚未明確，但可以通過現(xiàn)有的研究及結(jié)果進(jìn)行推測。本試驗(yàn)結(jié)果表明，甘油與DMA聯(lián)合互作會(huì)顯著提高精子活力、膜完整性等相關(guān)指標(biāo)，其作用結(jié)果顯著優(yōu)于單獨(dú)添加甘油。在甘油與DMA聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，甘油含量為2.0%左右時(shí)冷凍和解凍后的效果最好。對此進(jìn)行分析，主要可能因?yàn)楫?dāng)僅存在甘油時(shí)，精子只能依賴甘油來抵御冷凍損傷，當(dāng)甘油含量過低時(shí)不能在精子外部形成很好的保護(hù)膜，而過多的甘油會(huì)使精子產(chǎn)生更大的毒性含量；而當(dāng)存在DMA時(shí)，甘油與DMA共同抵御冷凍損傷，所需甘油濃度下降，更高含量的甘油反而會(huì)損傷精子質(zhì)膜，降低精子活力。而適當(dāng)含量的甘油與DMA聯(lián)合使用時(shí)，利用其滲透性大小的特性，可以同時(shí)保護(hù)精子的內(nèi)外部，使精子減少一部分冷凍損傷。

單獨(dú)添加時(shí)，甘油比DMA更適合作為綿羊精液的冷凍保護(hù)劑。DMA不能完全代替甘油，但是兩者協(xié)同作用亦能提高冷凍效果。DMA在稀釋液中添加，在精子冷凍-解凍后產(chǎn)生的效果不相同，存在一定的爭議，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在綿羊精液冷凍保存過程中，甘油與DMA通過相互協(xié)同作用提高了精子冷凍保存效果。其中當(dāng)甘油濃度為3.0%、DMA濃度為2.0%時(shí)精子冷凍保存效果最佳。