痛風(fēng)片提取與成型工藝的優(yōu)化

姜墾 包旭宏 劉海龍 路杰 張宇

痛風(fēng)（Gout）是單鈉尿酸鹽晶體（Monosodium urate，MSU）沉積在關(guān)節(jié)周圍所致的一種炎癥，與代謝性疾病高尿酸血癥息息相關(guān)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]，我國痛風(fēng)發(fā)病率為0.86%～2.20%，其中男性患病率遠(yuǎn)高于女性，并呈逐年增長趨勢(shì)。目前痛風(fēng)的治療重點(diǎn)在于控制尿酸水平，主要包括減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)尿酸排泄或抑制尿酸生成[3]。

藏醫(yī)藥是祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的一顆明珠，其有效性已得到越來越多人的認(rèn)可，藏醫(yī)藥干預(yù)痛風(fēng)以分期論治思想結(jié)合病癥特點(diǎn)取得了良好效果[4]。痛風(fēng)片由獨(dú)一味、決明子、訶子、寬筋藤、黃葵子等八味藏藥材組成，是蘭州市奇正中藏醫(yī)醫(yī)院的經(jīng)驗(yàn)方，具有祛風(fēng)止痛、清熱利濕的功效，用于濕熱瘀阻所致的痛風(fēng)病。本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)結(jié)合信息熵理論優(yōu)化痛風(fēng)片的提取工藝，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法結(jié)合總評(píng)歸一法（OD）優(yōu)化痛風(fēng)片的成型工藝，以期為痛風(fēng)片新藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琪）、立式超純水機(jī)（MOLgene120d，甘肅摩勒科學(xué)有限公司）、電子天平（YP-2001N，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；分析天平（XS205DU，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、高效液相色譜儀（Agilent 1260，安捷倫科技（中國）有限公司）、BJ-Ⅱ崩解時(shí)限儀（天津市光學(xué)儀器廠）、PYD-Ⅰ型片劑硬度測(cè)試儀（天津市藍(lán)深科技發(fā)展有限公司）、CSD-Ⅱ型脆碎度檢測(cè)儀（天津市藍(lán)深科技發(fā)展有限公司），ZPY-9型10沖旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)（青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司）。

1.2 試劑與藥物 獨(dú)一味（批號(hào)20210428-02）、黃葵子（批號(hào)180601）、寬筋藤（批號(hào)20030034）、決明子（批號(hào)180401-1）、車前子（批號(hào)202003001）、訶子（批號(hào)2007211）等藥材均來源于甘肅奇正藏藥有限公司，山梔苷甲酯對(duì)照品（批號(hào)111873-202004）、8-O-乙酰山梔苷甲酯對(duì)照品（批號(hào)111872-201703）均來源于中國食品藥品檢定研究院。

淀粉、微晶纖維素、糊精、羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂、交聯(lián)聚維酮均為藥用規(guī)格；乙腈為色譜純[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；其他均為分析純（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；水為純化水。

2 方法

2.1 山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為安捷倫Ecplise Plus C18柱（4.6×250mm，5.0μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～10min，8%→10%A；10～25min，10%A；25～29min，10%→14%A；29～45min，14%→16%A；45～55min，16%→20%A；55～60min，20%→80%A）流速為1ml/min，檢測(cè)波長235nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為10μl。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱定山梔苷甲酯對(duì)照品10.64mg、8-O-乙酰山梔苷甲酯對(duì)照品11.04mg置于25ml容量瓶中，以色譜甲醇溶解定容，搖勻，超聲處理作為山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯對(duì)照品儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液10、5、2、1、0.5、0.2ml分別定容至10ml容量瓶中，超聲、搖勻，得到不同濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱定1g水提濃縮液真空干燥物，精密移取25ml 70%甲醇，水浴加熱回流1h，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足失重，用0.22μm微孔濾膜過濾，取濾液，即可獲得供試品溶液。

2.1.4 陰性供試品溶液制備 對(duì)不含獨(dú)一味藥材的痛風(fēng)片處方加8倍水回流提取3次，每次0.5h，合并濾液，減壓濃縮至100ml，真空干燥，粉碎至過4號(hào)篩，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備缺獨(dú)一味的陰性對(duì)照品溶液。

2.1.5 專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取上述供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液各10μl，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見圖1，結(jié)果陰性無干擾，表明專屬性良好。

圖1 痛風(fēng)片提取液中山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯高效液相色譜圖

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10μl，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，見表1。表明2種指標(biāo)成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 2種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下32.89μg/ml的山梔苷甲酯與31.90μg/ml的8-O-乙酰山梔苷甲酯對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯峰面積的RSD分別為0.14%、0.30%。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液室溫放置，分別于0、2、4、6、8、12、24h精密吸取10μl進(jìn)樣分析，結(jié)果山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯峰面積的RSD分別為2.40%、1.43%。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯峰面積的RSD分別為0.58%、1.99%。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品溶液，分別加入山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯對(duì)照品適量，進(jìn)樣分析，計(jì)算供試品在低、中、高濃度下山梔苷甲酯的平均回收率分別為104.09%、102.32%和101.54%；8-O-乙酰山梔苷甲酯的平均回收率為94.13%、97.02%和98.95%。

2.2 干膏得率的測(cè)定 取90g痛風(fēng)片配方藥材，加適量水煎煮，將回流提取水煎液濃縮、定容至100ml容量瓶中，精密量取25ml置入已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后于105℃烘箱中干燥3h，取出放于干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定重量，計(jì)算干膏得率。干膏得率（%）=（含干膏蒸發(fā)皿質(zhì)量-蒸發(fā)皿質(zhì)量）×20/100×100%[5]。

2.3 提取工藝考察

2.3.1 吸水率考察 取處方量飲片3份，每份90g，置于干燥燒杯中，加入500ml蒸餾水，封口，浸泡至藥材無白心，稱定濕重，計(jì)算平均吸水率為206%。吸水率=（濕藥材重量-干藥材重量）/干藥材重量×100%。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于傳統(tǒng)水煎工藝，選擇以水為提取溶劑，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)確定加水量以原藥材的8、10、12倍，提取時(shí)間為0.5、1、1.5h，提取次數(shù)選擇1、2、3次進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，擬定L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯的含量、干膏得率為評(píng)分指標(biāo)，采用熵權(quán)法對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重系數(shù)分配，計(jì)算綜合評(píng)分，確定最佳提取工藝，因素水平見表2。

表2 痛風(fēng)片提取工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.3.3 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 權(quán)重分析是通過熵權(quán)法對(duì)各指標(biāo)的重要性進(jìn)行權(quán)重輸出，根據(jù)信息熵的定義，對(duì)于某項(xiàng)指標(biāo)，可以用熵值來判斷離散程度，其信息熵值越小，指標(biāo)的離散程度越大，該指標(biāo)對(duì)綜合評(píng)價(jià)的影響（即權(quán)重）就越大，因此，可利用信息熵這個(gè)工具，計(jì)算出各個(gè)指標(biāo)的權(quán)重，為多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)提供依據(jù)[6，7]。通過計(jì)算，結(jié)果見表3。

表3 痛風(fēng)片提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重

根據(jù)各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)對(duì)正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)分。綜合評(píng)分=山梔苷甲酯含量/山梔苷甲酯含量最大值×0.2876×100+8-O-乙酰山梔苷甲酯含量/8-O-乙酰山梔苷甲酯含量最大值×0.3484+干膏得率/干膏得率最大值×0.3639。正交實(shí)驗(yàn)見表4，利用方差分析確定最優(yōu)提取工藝，見表5。

表4 痛風(fēng)片提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 痛風(fēng)片提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析得到各因素對(duì)痛風(fēng)片水提工藝最主要因素為煎煮次數(shù)（C），其中加水倍數(shù)（A）和煎煮時(shí)間（B），各因素不同水平影響為A3>A2>A1，B3>B2>B1，C3>C2>C1（其中數(shù)字代表因素所對(duì)應(yīng)的水平）。經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)因素3（提取次數(shù)）各水平間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及生產(chǎn)實(shí)際確定最佳提取工藝水平組合為A1B1C3，即加8倍量水煎煮3次，每次0.5h。

2.3.4 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 稱取處方藥材90g，共3份，按“2.3.2”至此項(xiàng)下的優(yōu)化工藝進(jìn)行3批實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，見表6，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表6 痛風(fēng)片提取工藝驗(yàn)證結(jié)果

2.4 成型工藝研究

2.4.1 片芯制備方法的確定 稱取處方藥材，加8倍量水煎煮3次，每次0.5h，過濾，合并濾液，噴霧干燥得到浸膏粉，將本品與填充劑過60目篩3遍混合均勻，加入適量的潤濕劑制軟材，過20目篩擠壓制得顆粒，40℃烘干，整粒后與崩解劑和潤滑劑混合均勻，即可獲得片芯。

2.4.2 填充劑的選擇 本品具有吸濕性，長期放置會(huì)出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象，選擇合適的輔料可以改善主藥的吸濕性質(zhì)，常見的輔料有糖類、淀粉類、纖維素類等。痛風(fēng)患者常伴有高血壓、高血糖等疾病，不宜選擇糖類為填充劑，本實(shí)驗(yàn)選擇淀粉、糊精、微晶纖維素作為制劑的填充劑，按照“2.4.1”項(xiàng)的方法制備片芯，考察不同片芯制得片劑的硬度、脆碎度和崩解時(shí)限，見表7。

表7 填充劑篩選結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)以糊精、淀粉為填充劑時(shí)，脆碎度檢測(cè)時(shí)會(huì)出現(xiàn)碎片現(xiàn)象，以微晶纖維素為填充劑時(shí)各項(xiàng)均合格，考慮到微晶纖維素價(jià)格較高，在微晶纖維素中加入淀粉還能降低脆碎度，故選定微晶纖維素和淀粉為填充劑。

2.4.3 崩解劑的選擇 由于中藥浸膏片崩解時(shí)間較長，故需要加適宜的崩解劑促進(jìn)崩解。本實(shí)驗(yàn)在保持其他輔料不變的情況下，選擇羧甲基淀粉鈉和交聯(lián)聚維酮作為崩解劑篩選[8]，見表8。

表8 崩解劑篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以羧甲基淀粉鈉為崩解劑時(shí)脆碎度與硬度均好于交聯(lián)聚維酮，所以選擇以羧甲基淀粉鈉為崩解劑。同時(shí)考察崩解劑的加入方法，發(fā)現(xiàn)外加法得到的片劑硬度及碎度均合格，且崩解時(shí)限最短，綜合考慮選擇操作較易的外加法做為崩解劑的加入方法。見表9。

表9 崩解劑加入方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.4 潤濕劑的選擇 本品為中藥浸膏粉片，具有較強(qiáng)的粘性和吸濕性，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)只需要加入潤濕劑，顆粒就具有良好的成型性，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定95%乙醇為潤濕劑。

2.4.5 潤滑劑的選擇 硬脂酸鎂表面積大、易與顆粒混合，粘附性強(qiáng)，使片劑光滑美觀，在片劑中作為潤滑劑和抗粘劑廣泛使用[9]，考察用量對(duì)本品休止角、硬度、脆碎度及崩解時(shí)限的影響，見表10。可知潤滑劑用量對(duì)休止角和硬度無明顯影響，延長崩解時(shí)間，故本實(shí)驗(yàn)選擇0.2%硬脂酸鎂作為潤滑劑。

表10 潤滑劑篩選

2.4.6 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化片劑處方 在單因素實(shí)驗(yàn)篩選的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)制劑影響較大的微晶纖維素（MCC）、淀粉、羧甲基淀粉鈉（CMS-Na）的用量作為影響因素，以脆碎度（d1）、硬度（d2）、休止角（d3）和崩解時(shí)限（d4）的OD值為評(píng)價(jià)指標(biāo)[10]，計(jì)算公式為OD=（d1×d2×d3×d4）1/4。對(duì)于越大越好的指標(biāo)（如硬度）dn=（Yn-Ymin）/（Ymax-Ymin）；對(duì)于越小越好的指標(biāo)（如脆碎度、休止角和崩解時(shí)限）dn=（Ymax-Yn）/（Ymax-Ymin），實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表11，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表12。

表11 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

2.4.7 模型擬合與方差分析 采用Design-Expert10.0.1軟件對(duì)表12數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到方程為OD=-2.2115+4.0075A+3.7602B+0.1881C-4.48-42AB+0.0467AC-0.0479BC-0.5007A2-1.4424B2-0.0094C2，方差分析見表13。

表12 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表13 方差分析

2.4.8 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè) 利用Design Expert10.0.1軟件得到輔料與浸膏粉比例、淀粉與微晶纖維素比例、崩解劑用量各因素交互OD值的效應(yīng)面圖，見圖2。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的各比例范圍內(nèi)，通過Design Expert10.0.1軟件得到痛風(fēng)片最佳成型工藝：輔料與浸膏粉比例為0.42：1，淀粉與微晶纖維素比例為0.88：1，崩解劑用量為8.29%，OD值為0.7513。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)操作，將最優(yōu)成型工藝調(diào)整為輔料與浸膏粉比例為0.4：1，淀粉與微晶纖維素比例為0.85：1，崩解劑用量為8%。

圖2 3種因素交互OD值的效應(yīng)面圖

2.4.9 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 按優(yōu)化最佳工藝制備3批痛風(fēng)片進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，見表14。由此可知，OD值為0.7260，與預(yù)測(cè)值的OD值（0.7513）接近，表明模型預(yù)測(cè)性良好，可用于工藝參數(shù)的優(yōu)化。

表14 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3 討論

近年來，藏醫(yī)藥理論發(fā)展迅速，其中藏成藥在抗痛風(fēng)方面取得了顯著成就。痛風(fēng)片具有祛風(fēng)止痛、清熱利濕的功效，用于濕熱瘀阻所致的痛風(fēng)病。本方中所含藥物較多，煎煮過程中加水量、煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)等因素都會(huì)對(duì)復(fù)方提取液中活性成分的含量有影響，本實(shí)驗(yàn)通過熵權(quán)法對(duì)多指標(biāo)成分賦權(quán)，得到綜合評(píng)分，從而篩選最佳提取工藝。

臨床療效是由復(fù)方中多種活性成分共同發(fā)揮作用的結(jié)果，因此評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇是提取工藝中的重要一環(huán)，本實(shí)驗(yàn)以痛風(fēng)片復(fù)方中的君藥獨(dú)一味的有效成分與干膏得率為優(yōu)化指標(biāo)，朱斌[11]研究發(fā)現(xiàn)獨(dú)一味水提物能夠有效抑制慢性疼痛，馬文玉等[12]認(rèn)為獨(dú)一味鎮(zhèn)痛有效物質(zhì)是環(huán)烯醚萜苷類化合物山梔苷甲酯與8-O-乙酰山梔苷甲酯。干膏得率對(duì)后續(xù)片劑的成型工藝及服用劑量有極大影響，因此本實(shí)驗(yàn)選擇山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯和干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

中藥片劑的成型是個(gè)較為復(fù)雜的過程，提取物干膏粉的粉體學(xué)性質(zhì)、輔料的種類、制粒方法等[13]均會(huì)影響到片劑最終的成型。本方采用水提法，噴霧干燥得到的干膏粉粘性強(qiáng)、流動(dòng)性差、易吸濕，直接壓片不易成型，需要加入適宜的稀釋劑和助流劑進(jìn)行制粒、壓片。本實(shí)驗(yàn)采用濕法制粒，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)以75%、85%的乙醇為潤濕劑制軟材時(shí)易形成團(tuán)塊，出現(xiàn)“死顆?！保瑹o水乙醇制粒成本較高且干粉較多，最終選擇以95%乙醇制粒。在填充劑的選擇方面主要以微晶纖維素和淀粉的比例進(jìn)行篩選。中藥浸膏片通常不易崩解，本實(shí)驗(yàn)以硬度、脆碎度和崩解時(shí)限為指標(biāo)考察羧甲基淀粉鈉和交聯(lián)聚維酮的崩解作用，并確定外加法為崩解劑的加入方法。最后選擇對(duì)制劑影響較大的輔料用量、微晶纖維素和淀粉的比例、羧甲基淀粉鈉的用量進(jìn)行三因素五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的考察，結(jié)果顯示擬合效果較好，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確認(rèn)優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性較好。但實(shí)驗(yàn)室小試提取、成型工藝關(guān)鍵參數(shù)具有局限性，故今后進(jìn)行中試，以期為痛風(fēng)片的大規(guī)模生產(chǎn)提供重要依據(jù)。