不同育肥海區(qū)香港牡蠣的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)及基因表達(dá)相關(guān)性分析

嚴(yán)雪瑜，覃波忠，黃偉德，彭金霞，朱 鵬，蔣美君，張 斌，李選積，鐘方杰,，韋嬪媛,

（1.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北部灣大學(xué)海洋學(xué)院，廣西欽州 535011；2.欽州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西欽州 535000；3.廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西南寧 530021）

香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis），俗稱生蠔或大蠔，隸屬雙殼綱（Bivalvia）牡蠣科（Ostreidae），其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，干肉中含有蛋白質(zhì)45%～57%、脂肪7%～11%、糖元20%～40%，還富含多種維生素、必需氨基酸、牛磺酸以及鈣、鋅、硒等微量礦物元素，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。香港牡蠣屬于暖水性近岸海域?yàn)┩可L(zhǎng)品種，適宜鹽度范圍為5‰～25‰，主要分布于我國(guó)南方沿海地區(qū)，是廣西貝類養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種[2]。目前，廣西香港牡蠣成品蠔的養(yǎng)殖方式采取了每年秋、冬季節(jié)（10～11 月份）在近岸或?yàn)惩忾_(kāi)放性海域投放大規(guī)格牡蠣苗，進(jìn)行異地養(yǎng)成和育肥養(yǎng)殖的方法，從而快速獲得滿足上市規(guī)格的肥蠔[3]。相關(guān)研究表明，牡蠣主要營(yíng)養(yǎng)成分含量會(huì)隨著生長(zhǎng)時(shí)期的不同而呈現(xiàn)季節(jié)性變化[4]，生長(zhǎng)海域的水質(zhì)、鹽度、溫度、餌料種類和營(yíng)養(yǎng)組成等因素都會(huì)對(duì)香港牡蠣的生化組成和品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響[5?7]。目前，關(guān)于香港牡蠣營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的分析雖有報(bào)道，但針對(duì)不同育肥養(yǎng)殖海區(qū)中育肥期香港牡蠣的營(yíng)養(yǎng)組成和相關(guān)代謝基因的表達(dá)差異以及兩者之間的相關(guān)性等進(jìn)行系統(tǒng)比較分析尚未有深入研究。

廣西欽州是我國(guó)著名的“大蠔之鄉(xiāng)”，欽州灣水質(zhì)優(yōu)良，餌料豐富，是適宜香港牡蠣繁育生長(zhǎng)的天然牧場(chǎng)，也是香港牡蠣的主產(chǎn)區(qū)及苗種供應(yīng)地。欽州灣的牡蠣育肥養(yǎng)殖海區(qū)主要分布在大風(fēng)江和欽州港海域，均屬于海河口交界處，具有海水鹽度適中，餌料豐富等特點(diǎn)。因此，本文以育肥期的香港牡蠣為研究對(duì)象，對(duì)廣西欽州灣海域的大風(fēng)江和欽州港兩個(gè)育肥養(yǎng)殖海區(qū)的香港牡蠣主要營(yíng)養(yǎng)成分、礦物元素、氨基酸含量和營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行比較和相關(guān)性分析，為了解不同育肥養(yǎng)殖海區(qū)香港牡蠣的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)組成和相關(guān)遺傳背景，以及全面評(píng)價(jià)育肥期香港牡蠣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)候選基因的篩選奠定理論基礎(chǔ)，從而進(jìn)一步為香港牡蠣深加工及資源合理開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所用香港牡蠣樣品 分別采集于廣西欽州灣大風(fēng)江牡蠣育肥養(yǎng)殖海區(qū)（簡(jiǎn)稱大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)，N 21°38′24.10″，E 108°52′27.91″）和欽州港牡蠣育肥養(yǎng)殖海區(qū)（簡(jiǎn)稱欽州港養(yǎng)殖區(qū)，N 21°44′22.31″，E 108°34′4.28″），規(guī)格大小為：殼高10～15 cm、殼長(zhǎng)6～8 cm、殼寬4～6 cm、軟體組織重量30～40 g；石油醚、鹽酸、硼酸、氫氧化鈉、硫酸鉀、硝酸銀 分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠；TransZol RNA提取試劑盒、Trans Script All-in-one First-Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR 試劑盒、PerfectStartTM Green qPCR SuperMix 試劑盒 北京全式金生物公司。

GZX-GF101-3-BS 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；B180 馬弗爐 德國(guó)納博熱公司；消化爐 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；KDN-815 定氮儀、SZC101S1 脂肪測(cè)定儀 上海纖檢儀器有限公司；HITACHI 高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；Light Cycler 96 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀 瑞士羅氏公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理 分別于大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)和欽州港養(yǎng)殖區(qū)采集30 個(gè)育肥期（11～12 月份）的香港牡蠣樣品，所有樣品均活體開(kāi)殼取出全部軟體組織，每組隨機(jī)選取6 個(gè)牡蠣個(gè)體采集新鮮的外套膜、閉殼肌和鰓等組織樣品，置于液氮中冷凍后于?80 ℃的條件下保存待測(cè)；其余牡蠣樣品均取其整體的軟體組織，進(jìn)行組內(nèi)樣品混合和勻漿后于?20 ℃的條件下保存待測(cè)。

1.2.2 指標(biāo)的測(cè)定

1.2.2.1 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 香港牡蠣組織中的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定，其中能量參照GB 28050-2011（修訂版）進(jìn)行測(cè)定；蛋白質(zhì)參照GB 5009.5-2016（第一法）進(jìn)行測(cè)定；脂肪參照GB 5009.6-2016（第二法）進(jìn)行測(cè)定；氨基酸組分和含量參照GB 5009.124-2016 進(jìn)行測(cè)定；膽固醇參照GB 5009.128-2016（第二法）進(jìn)行測(cè)定；維生素A 和維生素E 參照GB 5009.82-2016（第一法）進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.2 礦物元素測(cè)定 香港牡蠣組織中的鈣（Ca）、鋅（Zn）、鈉（Na）、鎂（Mg）等礦物元素含量均參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.82-2016（第二法）進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.3 氨基酸測(cè)定與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定分析 香港牡蠣組織中的氨基酸組分和質(zhì)量分析參照GB 5009.124-2016 進(jìn)行測(cè)定和分析；根據(jù)1973 年FAO/WHO 提出的氨基酸計(jì)分模式和中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所提出的雞蛋蛋白模式進(jìn)行比較，并計(jì)算氨基酸評(píng)分（amino acid score，AAS）和化學(xué)評(píng)分（chemical score，CS）[8]。

AAS 和CS 的計(jì)算公式分別為：

AAS=被測(cè)蛋白質(zhì)氨基酸含量（mg/g N）/FAO/WHO 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式中相應(yīng)氨基酸含量（mg/g N）；

CS=被測(cè)蛋白質(zhì)氨基酸含量（mg/g N）/雞蛋蛋白質(zhì)中相應(yīng)氨基酸含量（mg/g N）。

1.2.3 香港牡蠣組織相關(guān)基因的表達(dá)分析

1.2.3.1 總RNA 提取和cDNA 合成 參照Trizol 法[9]利用TransZol RNA 提取試劑盒進(jìn)行組織總RNA 的提取，并根據(jù)RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 第1 鏈的合成。

1.2.3.2 引物設(shè)計(jì)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）上公布的牡蠣基因序列和相關(guān)參考文獻(xiàn)[10?12]，設(shè)計(jì)并合成熒光定量PCR 引物，如表1 所示。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系（20 μL）為：上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix反應(yīng)液10 μL，無(wú)核酸酶水7 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃ 5 s、58 ℃ 15 s、72 ℃ 10 s 擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)；以翻譯延伸因子1A（EF1A）為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物Table 1 The primer sequences for quantitative RT-PCR

1.2.4 香港牡蠣代謝基因表達(dá)和營(yíng)養(yǎng)成分相關(guān)性分析 利用SPSS 軟件對(duì)香港牡蠣代謝基因的相對(duì)表達(dá)量和營(yíng)養(yǎng)成分的數(shù)據(jù)進(jìn)行斯皮爾曼（Spearman）相關(guān)性分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS、GraphPad Prism 5 和Omic-Share Tools 等軟件或在線工具進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和圖片處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）”表示，顯著性分析采用配對(duì)樣品T檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同育肥養(yǎng)殖海區(qū)香港牡蠣常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分和礦物元素含量分析

研究顯示，牡蠣軟體組織中糖原具有呈味作用[13]，是影響牡蠣風(fēng)味特征的重要因子[14]，而水分含量則會(huì)影響牡蠣肉的濕度和多汁性，脂肪含量的變化也會(huì)賦予牡蠣不同的堅(jiān)實(shí)度和口感[15]。由表2 可知，欽州灣兩個(gè)養(yǎng)殖海區(qū)育肥期的香港牡蠣在能量、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、膽固醇和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分含量均存在不同程度的差異；其中，欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的能量、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、膽固醇、維生素A 和維生素E 等成分的含量均高于大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)，且膽固醇、維生素A 和維生素E 的含量組間差異顯著（P＜0.05），這3 種成分的含量分別是大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)的1.9、1.7 和1.6 倍；表明欽州灣不同育肥海區(qū)養(yǎng)殖的香港牡蠣的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量存在一定的差異，這可能與不同海域的海水理化環(huán)境存在差異有關(guān)。因?yàn)槟迪爩儆谧儩B透壓動(dòng)物，需要調(diào)整其生理代謝和能量分配來(lái)適應(yīng)不同的鹽度和環(huán)境的變化，從而影響了自身的營(yíng)養(yǎng)成分結(jié)構(gòu)和含量[16]。本試驗(yàn)結(jié)果與丁丹勇等[17]的研究相似，該研究認(rèn)為欽州、湛江東海島、湛江官渡、陽(yáng)西養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的營(yíng)養(yǎng)成分存在顯著差異，這可能與不同養(yǎng)殖區(qū)海水的鹽度差異有關(guān)。

表2 欽州灣不同養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量Table 2 The main nutritional composition contents of C.hongkongensis from different culture areas

研究表明，牡蠣中含有豐富的鈣、鐵、鋅、硒、鉀、鈉、鎂等人體生理功能重要的礦物質(zhì)元素[18?20]；其中，牡蠣組織中的微量元素鋅和硒是海產(chǎn)品含量之首[5]，鋅對(duì)人體的免疫功能起著調(diào)節(jié)作用，具有“生命之花”的美稱[21]；牡蠣還因其富含鈣和鋅等礦物質(zhì)元素而被稱為“海中牛奶”[22]。由表3 可知，大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的鈣、鈉和鎂等礦物元素的含量均顯著高于欽州港養(yǎng)殖區(qū)（P＜0.05），分別是欽州港養(yǎng)殖區(qū)的2.4、2.2 和1.6 倍；而欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的鋅元素含量則顯著高于大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)（P＜0.05），為大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)的1.7 倍。這可能是由于牡蠣對(duì)不同元素的累積與其所在海域的礦物元素含量存在著一定的差異有關(guān)，且部分元素間的累積存在相互競(jìng)爭(zhēng)或抑制作用[23]。林海生等[14]等研究也認(rèn)為牡蠣中金屬元素的含量具有一定的地域差異，其原因與牡蠣品種、生長(zhǎng)周期及其生長(zhǎng)海域環(huán)境中的礦物元素種類有關(guān)。

表3 欽州灣不同養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣主要礦物元素含量Table 3 The main mineral element contents of C.hongkongensis from different culture areas

2.2 不同育肥養(yǎng)殖海區(qū)香港牡蠣氨基酸組成及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值分析

不同育肥養(yǎng)殖海區(qū)香港牡蠣氨基酸組成及含量如表4 所示，除了色氨酸被酸水解外，欽州灣兩個(gè)養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣組織中檢測(cè)出了17 種常見(jiàn)氨基酸，包括7 種必需氨基酸、2 種半必需氨基酸和8 種非必需氨基酸，氨基酸總量為7.84～8.66 g/100 g，其中谷氨酸的含量最高，胱氨酸的含量最低。在兩個(gè)養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的氨基酸組成比較中，欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的苯丙氨酸、組氨酸、谷氨酸和丙氨酸等氨基酸含量顯著高于大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)（P＜0.05），其它氨基酸含量差異不顯著。氨基酸是牡蠣的一種重要滲透壓效應(yīng)物，牡蠣機(jī)體可通過(guò)氨基酸的代謝來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)的滲透壓，因此不同海區(qū)的牡蠣也會(huì)因其生長(zhǎng)環(huán)境的不同而在氨基酸的組成和含量方面存在差異[24]。

表4 欽州灣不同養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣氨基酸組成及含量Table 4 Amino acid composition and contents of C.hongkongensis from different culture areas

牡蠣蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值主要取決于其氨基酸種類的齊全程度和必需氨基酸含量的高低[20]。由表5可知，欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的必需氨基酸含量為3.08 g/100 g，占氨基酸總量的35.51%，與WHO/FAO模式推薦的模式（35.38%）接近[25]；而大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的必需氨基酸含量和比例分別為2.67 g/100 g 和34.06%，稍低于欽州港養(yǎng)殖區(qū)。欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣半必需氨基酸為0.91 g/100 g（10.51%），同樣高于大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)（0.73 g/100 g，9.31%）。

表5 欽州灣不同養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣氨基酸組成評(píng)價(jià)Table 5 Evaluation of amino acid composition in C.hongkongensis from different culture areas

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)香港牡蠣蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高低，采用FAO/WHO 評(píng)分模式和雞蛋蛋白的必需氨基酸含量作標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，欽州灣不同養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的氨基酸評(píng)分（AAS）和化學(xué)評(píng)分（CS）結(jié)果詳見(jiàn)表6。根據(jù)必需氨基酸組成評(píng)價(jià)，大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣纈氨酸的AAS 和CS 評(píng)分最低，為第一限制氨基酸；欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的第一限制氨基酸則為纈氨酸（AAS）和蛋氨酸+胱氨酸（CS）。根據(jù)AAS 評(píng)分，欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、蘇氨酸的AAS 評(píng)分均高于大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)，其中AAS 評(píng)分最高的是苯丙氨酸+酪氨酸（1.35）；根據(jù)CS 評(píng)分，欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、蘇氨酸的CS 評(píng)分也高于大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)，其中CS 評(píng)分最高的是賴氨酸（0.94）。因此，欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的氨基酸平衡效果相對(duì)更好，含量豐富且均勻，蛋白質(zhì)質(zhì)量好，均屬于優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表6 欽州灣不同養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣必需氨基酸評(píng)分Table 6 Scores of essential amino acids of C.hongkongensis from different culture areas

牡蠣的鮮美口感還在一定程度上取決于谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸等4 種風(fēng)味氨基酸的組成和含量，其中谷氨酸和天冬氨酸是呈鮮味的特征氨基酸，而甘氨酸和丙氨酸則是呈甘味的特征氨基酸[17,26]。欽州灣兩個(gè)養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的風(fēng)味氨基酸的總含量為3.24～3.50 g/100 g，欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸的含量以及風(fēng)味氨基酸總量（3.50 g/100 g）均高于大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)（3.24 g/100 g），但風(fēng)味氨基酸占氨基酸總量的比例（40.42%）卻低于大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)（41.33%），表明大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的鮮美程度相對(duì)較高。黃艷球等[27]對(duì)比了廣西欽州、廣東陽(yáng)江、廣東湛江和廣東汕頭四個(gè)養(yǎng)殖區(qū)的香港牡蠣的氨基酸組成和含量，也發(fā)現(xiàn)欽州大蠔在氨基酸總量、必需氨基酸、非必需氨基酸含量以及在風(fēng)味氨基酸天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量方面都具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

2.3 不同育肥養(yǎng)殖海區(qū)香港牡蠣營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)基因組織表達(dá)分析

由圖1 可知，δ-1 吡咯啉-5-羧酸合成酶（delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase，P5CS）、糖原磷酸酶（glycogen phosphorylase，GP）、雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶（dual-specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase，DYRK）和膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol-regulatory element binding protein，SREBP）等四個(gè)營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量在香港牡蠣外套膜、閉殼肌和鰓等不同組織的組間表達(dá)趨勢(shì)完全一致，均表現(xiàn)為在同組不同組織內(nèi)整體呈上調(diào)或下調(diào)趨勢(shì)；其中，欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的P5CS、GP和SREBP的基因相對(duì)表達(dá)量高于大風(fēng)江組，而DYRK基因的組織表達(dá)結(jié)果則低于大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)，但組間差異均不顯著（P＞0.05）。

圖1 香港牡蠣營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)基因的組織表達(dá)分析Fig.1 Metabolism-related gene expression of C.hongkongensis in different tissues

P5CS基因是氨基酸代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶，可以催化谷氨酸還原，該步驟是合成脯氨酸、鳥(niǎo)氨酸和精氨酸的關(guān)鍵步驟[28]。欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的P5CS基因在外套膜、閉殼肌和鰓等組織的相對(duì)表達(dá)量分別是大風(fēng)江組的3.0、4.0 和1.6 倍，表明欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣在氨基酸代謝及合成脯氨酸、鳥(niǎo)氨酸和精氨酸等方面更有優(yōu)勢(shì)。GP基因與葡萄糖代謝相關(guān)，琥珀酸脫氫酶在三羧酸循環(huán)中可以催化琥珀酸氧化成延胡索酸[29]，而GP通過(guò)釋放葡萄糖-1-磷酸催化糖原分解，是這個(gè)過(guò)程的限速步驟[30]。欽州港組GP基因在外套膜、閉殼肌和鰓等組織的相對(duì)表達(dá)量分別是大風(fēng)江組的1.4、1.9 和1.0 倍，表明欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣具有更強(qiáng)的葡萄糖代謝能力。

DYRK基因是一種劑量依賴性的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，該基因家族成員可磷酸化許多底物，包括細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[31]，可以通過(guò)減少體脂來(lái)抑制肥胖等代謝病[32]。此外，李春燕[11]通過(guò)Quantitative trait locus（QTL）分析認(rèn)為DYRK基因是可影響牡蠣生長(zhǎng)和脂肪酸性狀的重要標(biāo)記基因。SREBP基因是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)錄因子，可以激活下游的脂肪合成相關(guān)酶基因，促進(jìn)脂質(zhì)的合成與沉積[33?37]。大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的DYRK基因在外套膜、閉殼肌和鰓等組織的相對(duì)表達(dá)量分別是欽州港養(yǎng)殖區(qū)的1.3、6.7 和1.3 倍，而欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的SREBP基因在外套膜、閉殼肌和鰓等組織的相對(duì)表達(dá)量分別是大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)的8.2、16.4 和16.1 倍，因此推測(cè)大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的脂肪分解代謝能力更強(qiáng)，而欽州港養(yǎng)殖區(qū)的香港牡蠣可能在脂肪合成與沉積上更有優(yōu)勢(shì)。

2.4 香港牡蠣代謝基因表達(dá)和營(yíng)養(yǎng)成分相關(guān)性分析

由圖2 可知，DYRK的基因表達(dá)量和香港牡蠣常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的相關(guān)性明顯與P5CS、GP和SREBP這3 個(gè)基因的結(jié)果相反，表現(xiàn)為DYRK基因的表達(dá)量與能量、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、膽固醇、維生素A 和維生素E 等含量均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；牡蠣的遺傳圖譜與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀QTL 定位分析發(fā)現(xiàn)DYRK基因與花生四烯酸的代謝相關(guān)[11]，花生四烯酸是一種ω-6 多不飽和脂肪酸，具有酯化膽固醇的作用，因此DYRK基因可能在脂肪酸代謝過(guò)程中具有一定的調(diào)控作用。P5CS、GP和SREBP這3 個(gè)基因的表達(dá)量則表現(xiàn)為與香港牡蠣的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量整體呈正相關(guān)關(guān)系，這3 個(gè)基因的功能分別與氨基酸代謝、葡萄糖代謝及脂質(zhì)合成有關(guān)，相關(guān)性分析結(jié)果與其基因功能基本相符，表明P5CS、GP和SREBP這3 個(gè)基因與香港牡蠣的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的相關(guān)性具有一致性。此外，GP基因的功能與糖原分解和葡萄糖代謝密切相關(guān)，而相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)GP基因的表達(dá)量與能量、脂肪、膽固醇和維生素E 的含量極顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明GP基因與香港牡蠣的能量、脂肪、膽固醇和維生素E 這4 個(gè)營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)的相關(guān)性較強(qiáng)，進(jìn)一步說(shuō)明GP基因是研究香港牡蠣營(yíng)養(yǎng)代謝的關(guān)鍵候選基因。

圖2 香港牡蠣基因表達(dá)與常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的相關(guān)性熱圖Fig.2 Heatmap of the correlation between gene expression and the main nutrient composition of C.hongkongensis

香港牡蠣代謝基因表達(dá)和17 種氨基酸含量的相關(guān)性分析結(jié)果如圖3 所示，P5CS、GP和SREBP這3 個(gè)基因的表達(dá)量與蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸等多種氨基酸的含量整體呈正相關(guān)關(guān)系；P5CS基因是氨基酸代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶，對(duì)脯氨酸、鳥(niǎo)氨酸和精氨酸的合成具有重要的作用，GP和SREBP的基因功能則分別與葡萄糖代謝和脂肪合成有關(guān)，而苯丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸等生糖氨基酸或生酮氨基酸又可通過(guò)不同的途徑合成糖類和脂類，因此P5CS、GP和SREBP這3 個(gè)基因可能參與了多種氨基酸的代謝調(diào)控過(guò)程[38]。由圖3 可以看出，DYRK基因的表達(dá)量則與脯氨酸、甘氨酸和胱氨酸呈正相關(guān)關(guān)系，與天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸等14 種氨基酸的含量呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，但DYRK基因參與氨基酸代謝過(guò)程的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。綜上所述，相關(guān)性分析結(jié)果表明P5CS、GP和SREBP等基因可能與香港牡蠣的營(yíng)養(yǎng)成分及多種氨基酸合成和代謝具有一定的正向協(xié)同作用。

圖3 香港牡蠣基因表達(dá)與氨基酸含量的相關(guān)性熱圖Fig.3 Heatmap of the correlation between gene expression and the amino acid contents of C.hongkongensis

3 結(jié)論

本研究測(cè)定了廣西欽州灣兩個(gè)育肥養(yǎng)殖海區(qū)香港牡蠣的營(yíng)養(yǎng)成分和代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況，并首次分析了育肥期香港牡蠣營(yíng)養(yǎng)成分和基因表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，大風(fēng)江和欽州港兩個(gè)育肥養(yǎng)殖海區(qū)的香港牡蠣的組織營(yíng)養(yǎng)成分存在一定的差異：與大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)相比，欽州港養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的必需氨基酸的含量和比例以及必需氨基酸評(píng)分更高，表明其氨基酸平衡效果好，含量豐富且均勻，屬于優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；而大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣在鈣、鈉和鎂等礦物元素的含量上更有優(yōu)勢(shì)，且其風(fēng)味氨基酸的比例高于欽州港養(yǎng)殖區(qū)牡蠣，表明大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣鮮味程度更佳。此外，基因表達(dá)及相關(guān)性分析結(jié)果表明，欽州港養(yǎng)殖區(qū)的香港牡蠣可能在涉及氨基酸、葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和脂肪合成等方面的基因表達(dá)量更高，而大風(fēng)江養(yǎng)殖區(qū)香港牡蠣的DYRK基因表達(dá)量更高，提示其在脂肪分解代謝及脯氨酸、甘氨酸和胱氨酸合成等方面的基因表達(dá)上更有優(yōu)勢(shì)。本研究為全面認(rèn)識(shí)不同海區(qū)育肥期香港牡蠣的營(yíng)養(yǎng)特征及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)候選基因的篩選提供了理論依據(jù)，對(duì)香港牡蠣深加工及資源合理開(kāi)發(fā)利用具有一定的參考價(jià)值。