超聲細(xì)胞破碎儀輔助提取桑葚多糖及其抗氧化性分析

張秋紅

(商丘學(xué)院風(fēng)景園林學(xué)院，河南 商丘 476000)

桑葚(FructusMori)為?？浦参锏某墒旃?，是一種藥食同源植物，具有抗炎癥[1]、預(yù)防腦缺血[2]等作用。多糖作為桑葚的主要活性物質(zhì)之一，具有降血糖、抗氧化、保護(hù)腎臟調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[3-4]。目前桑葚多糖的提取方法有酶法提取、超聲波輔助提取、酶—超聲波聯(lián)合提取、微波輔助提取、大孔吸附樹脂純化提取、熱水提取法、高速剪切提取等[5-7]。但這些方法工藝復(fù)雜、提取時間長、提取率低。王慶等[8]報(bào)道了提取方法對多糖得率和活性都有一定的影響。祝新媛[9]研究了不同提取方法對桑葚多糖提取率的影響，得出超聲輔助提取法的提取率比單獨(dú)熱水提取法的高。與傳統(tǒng)超聲波清洗機(jī)輔助提取法比較，細(xì)胞破碎儀在桑葚樣品中可形成更強(qiáng)烈的空化效應(yīng)，桑葚樣品的細(xì)胞壁被儀器形成的高度局部化溫度、沖擊波和剪切力破壞，增大了樣品與萃取浸提液的接觸面積[10]。因此，研究擬采用超聲波細(xì)胞破碎儀輔助熱水浸提法提取桑葚多糖，并對桑葚多糖的抗氧化能力進(jìn)行分析，為今后桑葚多糖的分離、純化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑桑葚干：新疆和田市絲路果果特產(chǎn)；

石油醚(沸程30～60 ℃)、三氯甲烷、正丁醇、95%乙醇：分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波細(xì)胞破碎儀：TL-ST400型，江蘇天翎儀器有限公司；

高速多功能粉碎機(jī)：RHP-2000A型，天津榮浩機(jī)電設(shè)備有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，上海樹立儀器儀表有限公司；

高速離心機(jī)：TCL-16型，常州金壇良友儀器有限公司；

粗脂肪測定儀：SZF-06A型，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DGH-9140A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚樣品處理 將桑葚干樣品烘干至恒重，粉碎，過70目篩后密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 脫脂 參照GB 5009.6—2016并修改。稱取處理好的桑葚樣品4.000 g，水浴溫度70 ℃回流抽提4 h，控制每分鐘80滴左右。脫脂后濾掉廢液得桑葚樣品。

1.3.3 細(xì)胞破碎儀輔助熱水浸提桑葚多糖 稱取脫脂后的桑葚樣品1.000 g，按料液比1∶30 (g/mL)加入蒸餾水，65 ℃恒溫水浴鍋中用細(xì)胞破碎儀輔助浸提，將超聲波細(xì)胞破碎儀變幅桿末端插入液面8 mm并使其位于容器中心位置。變幅桿轉(zhuǎn)換開關(guān)打到Φ6，設(shè)置超聲時間1.2 s，間歇時間1.5 s，用紗布過濾混合物， 3 500 r/min離心10 min，收集上清液，65 ℃水浴濃縮至液體體積為10 mL。

1.3.4 桑葚多糖的脫蛋白 根據(jù)文獻(xiàn)[9]稍作修改：將濃縮后的桑葚樣品置于分液漏斗中，按體積比1∶2加入Sevag試劑(V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1)，充分搖勻，靜置，待分液漏斗中液體分層完畢后，除去底層的有機(jī)溶劑及中間層的蛋白質(zhì)，收集上層液，3 500 r/min離心10 min，除去殘留蛋白質(zhì)，收集上清液備用。

1.3.5 桑葚多糖的制備 向脫蛋白后的上清液中加入4倍體積95%乙醇，混勻靜置片刻后沉淀析出，3 500 r/min離心10 min，棄上清，將沉淀放置于蒸發(fā)皿中，65 ℃干燥1.5 h，即為桑葚多糖提取物。

1.3.6 桑葚多糖得率測定 按式(1)計(jì)算桑葚多糖得率[9]。

X=M/m×100%，

(1)

式中：

X——桑葚多糖得率，%；

M——桑葚多糖的質(zhì)量，g；

m——脫脂桑葚粉的質(zhì)量，g。

1.3.7 單因素試驗(yàn)

(1) 浸提時間：固定料液比1∶30 (g/mL)，浸提溫度60 ℃，細(xì)胞破碎儀超聲時間7.5 min，超聲功率100 W，考察浸提時間[11](20，30，40，50，60 min)對桑葚多糖得率的影響。

(2) 料液比：固定浸提時間30 min，浸提溫度60 ℃，超聲時間7.5 min，超聲功率100 W，考察料液比[1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)] 對桑葚多糖得率的影響。

(3) 超聲時間：固定浸提時間30 min，料液比1∶30 (g/mL)，浸提溫度60 ℃，超聲功率100 W，考察超聲時間(7.5，10.0，12.5，15.0，17.5 min)對桑葚多糖得率的影響。

(4) 超聲功率：固定浸提時間30 min，料液比1∶30 (g/mL)，超聲時間15 min，浸提溫度60 ℃，考察超聲功率(100，120，140，160，180 W)對桑葚多糖得率的影響。

(5) 浸提溫度：固定浸提時間30 min，料液比1∶30 (g/mL)，細(xì)胞破碎超聲時間15 min，超聲功率160 W，考察浸提溫度(30，40，50，60，70 ℃)對桑葚多糖得率的影響。

1.3.8 桑葚多糖的抗氧化性

(1) DPPH自由基清除能力：根據(jù)文獻(xiàn)[9]。

(2) 羥自由基清除能力：根據(jù)文獻(xiàn)[9]并修改，取1 mL硫酸亞鐵溶液(9 mmol/mL)，1 mL水楊酸的無水乙醇溶液(9 mmol/mL)，1 mL不同質(zhì)量濃度桑葚多糖樣液(0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90 mg/mL)，1 mL H2O2溶液(8.8 mmol/mL)后搖勻，37 ℃ 反應(yīng)30 min，測定517 nm處吸光值A(chǔ)1。用1 mL蒸餾水代替桑葚多糖樣液，記517 nm處吸光值為A0，用1 mL 蒸餾水代替過氧化氫溶液，記517 nm處吸光值為A2。以維生素C為對照品，按式(2)計(jì)算羥自由基清除活性。

X=[1-(A1-A2)/A0]×100%，

(2)

式中：

X——羥自由基清除率，%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個試驗(yàn)重復(fù)3次，利用SPSS 22.0、Office 2016軟件繪圖和統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1(a)可知，在一定浸提時間內(nèi)，多糖溶出量會增加，但長時間的高溫浸提也會導(dǎo)致桑葚多糖的降解[12]，桑葚多糖在浸提時間為30 min時得率達(dá)到最大值(6.16±0.02)%。因此，適宜的浸提時間為30 min，與譚西[13]的研究相比，細(xì)胞破碎儀輔助提取的效果更好，但浸提時間對得率的影響變化趨勢較小。

圖1 各因素對桑葚多糖得率的影響

由圖1(b)可知，料液比過小，不利于桑葚多糖的溶出，料液比增大桑葚多糖溶出量增加，料液比為1∶30 (g/mL)時，桑葚多糖得率達(dá)最高值(6.19±0.06)%。當(dāng)桑葚多糖充分溶出后，溶劑中桑葚多糖的量已基本恒定，再增大溶劑的量，溶劑中桑葚多糖的量也不會增加[14]，因此適宜的料液比為1∶20～1∶40 (g/mL)。

由圖1(c)可知，一定范圍內(nèi)超聲時間延長有助于提高桑葚多糖得率，但長時間超聲會導(dǎo)致部分多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生降解，使得到的水溶性多糖分支增加[15]，得率下降, 在15 min時達(dá)最大值(6.20±0.10)%。因此適宜的超聲時間為12.5～17.5 min。景榮琴等[11]研究得到的超聲時間為23.5 min，較試驗(yàn)時間長，說明細(xì)胞破碎儀輔助提取桑葚多糖更省時高效。

由圖1(d)可知，隨著超聲功率的增大，超聲波空化作用增強(qiáng)，產(chǎn)生的空化泡破碎越劇烈，桑葚多糖得率越高。但超聲功率過高，桑葚多糖結(jié)構(gòu)可能被破壞而相對減少[16],在160 W時達(dá)最大值(6.23±0.04)%。魏然等[17]研究得到的最佳超聲功率為360 W，遠(yuǎn)高于試驗(yàn)的超聲功率，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞破碎儀的空化效應(yīng)比超聲波清洗機(jī)更強(qiáng)。因此，適宜的超聲功率為140～180 W。

由圖1(e)可知，桑葚多糖得率隨浸提溫度的升高而增大，當(dāng)浸提溫度為40 ℃時，多糖得率達(dá)最大值(6.25±0.02)%，之后逐漸下降，與陳禹等[18]、廖登未等[19]的變化趨勢一致。浸提液溫度的升高會加速水分子運(yùn)動，促進(jìn)桑葚多糖溶出，提高桑葚多糖得率，但過高的溫度可能會使桑葚多糖發(fā)生降解，破壞多糖的糖苷鍵，使桑葚多糖得率降低。故適宜的浸提溫度為30～50 ℃。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，選擇細(xì)胞破碎儀超聲功率、料液比、超聲時間以及浸提溫度為因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。正交試驗(yàn)因素水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

由表2可知，各因素對桑葚多糖得率的影響主次關(guān)系為超聲功率>浸提溫度>超聲時間>料液比。由表3可知，超聲功率、超聲時間及浸提溫度對桑葚多糖得率的影響均顯著(P<0.05)，料液比的影響不顯著，與極差分析結(jié)果一致。桑葚多糖最優(yōu)的提取條件組合為A2B1C2D1，即超聲功率160 W、超聲時間12.5 min、料液比1∶30 (g/mL)、浸提溫度30 ℃。但實(shí)際最優(yōu)組合為A2B3C1D2，即超聲功率160 W、超聲時間17.5 min、料液比1∶20 (g/mL)、浸提溫度40 ℃。由于兩組試驗(yàn)結(jié)果不一致，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=3)，得桑葚多糖得率分別為(6.63±0.07)%，(6.28±0.12)%。因此桑葚多糖最佳浸提條件為超聲功率160 W、超聲時間12.5 min、料液比1∶30 (g/mL)、浸提溫度30 ℃。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 正交設(shè)計(jì)方差分析?

2.3 桑葚多糖的抗氧化能力

2.3.1 清除DPPH·活性 由圖2可知，當(dāng)桑葚多糖樣品質(zhì)量濃度從0.10 mg/mL升高至0.90 mg/mL時，其對DPPH·的清除率隨溶液質(zhì)量濃度的增加逐漸增大，與祝新媛[9]的研究結(jié)論一致。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度>0.70 mg/mL，桑葚多糖對DPPH·的清除率趨于平緩，顯著弱于相同濃度下維生素C的清除能力(P<0.05)。

圖2 對DPPH·的清除能力

2.3.2 清除·OH活性 由圖3可知，桑葚多糖對·OH有較強(qiáng)的清除能力，且清除活性與樣品質(zhì)量濃度呈正比。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.90 mg/mL時，桑葚多糖對·OH的清除率達(dá)(76.21±2.21)%，但顯著低于對照品維生素C的[(87.29±3.15) %](P<0.05)，說明桑葚多糖對·OH有一定的清除力，與李德龍等[20]研究的結(jié)論一致。

圖3 對·OH的清除能力

3 結(jié)論

采用超聲波細(xì)胞破碎儀輔助熱水浸提法提取了桑葚多糖。結(jié)果表明，各因素對桑葚多糖提取率影響順序?yàn)槌暪β?浸提溫度>超聲時間>料液比，且最佳提取工藝條件為浸提時間30 min、料液比1∶30 (g/mL)、超聲功率160 W、超聲時間12.5 min、浸提溫度30 ℃，該條件下桑葚多糖得率為(6.63±0.07)%。此外，桑葚多糖具有一定的抗氧化性，但清除DPPH·和·OH的能力較維生素C的弱。

后期研究將進(jìn)一步從以下方面入手：① 對桑葚多糖抗氧化活性成分構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究；② 對桑葚多糖進(jìn)行分離純化以提高多糖純度；③ 對桑葚多糖的藥理效果如潰瘍性結(jié)腸炎保護(hù)作用、抗急性酒精性肝損傷活性進(jìn)行探究。