GC-MS法測(cè)定保健食品中他汀類藥物含量的不確定度評(píng)定

張麗霞 郭慶園 華啟誠(chéng) 李向梅

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510000；2. 清遠(yuǎn)海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，廣東 清遠(yuǎn) 511515；3. 廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510000)

他汀類物質(zhì)是減肥類保健食品中常檢出的非法添加化合物[1]。其作用機(jī)理是通過阻斷羥甲戊酸的代謝途徑，增加細(xì)胞膜表面低密度脂蛋白受體的活性，致使血清中膽固醇被加速清除，從而達(dá)到降脂減肥的效果[2-3]。但過量食用他汀類化合物不僅會(huì)引發(fā)橫紋肌溶解等肌肉類疾病[4]還會(huì)導(dǎo)致急性腎衰[5-6]。常見的非法添加他汀類物質(zhì)包括洛伐他汀、美伐他汀及辛伐他汀等[7-8]。

目前，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局規(guī)定的他汀類物質(zhì)檢測(cè)方法為提取食品中的他汀類物質(zhì)后直接用LC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定[9]，該方法未涉及樣品測(cè)定前的凈化步驟。孫麗萍等[10]將提取后的他汀類樣品直接進(jìn)行HPLC測(cè)定然后評(píng)定該方法的合成不確定度，結(jié)果表明重復(fù)性分量擬合的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度占比54%。保健食品的基質(zhì)復(fù)雜[11]，適當(dāng)凈化可提高檢測(cè)結(jié)果的精密度，同時(shí)還能規(guī)避樣品基質(zhì)對(duì)儀器的污染。水—氯化鈉鹽析法常用于去除果蔬農(nóng)藥殘留中水分等物質(zhì)[12]，因此在他汀類物質(zhì)檢測(cè)方法的前處理過程引入水—氯化鈉鹽析步驟可以有效地溶解保健食品中色素、糖類等干擾物質(zhì)。研究擬采用水—氯化鈉鹽析法對(duì)保健食品提取物進(jìn)行凈化，然后利用GC-MS檢測(cè)美伐他汀、洛伐他汀及辛伐他汀含量，根據(jù)CNAS-GL 06—2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》和JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》的要求并結(jié)合文獻(xiàn)[13-16]，建立相關(guān)數(shù)學(xué)模型，分析及評(píng)定各不確定度分量的來源，最后利用不確定度評(píng)定對(duì)水—氯化鈉前處理保健食品的檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀：100 mg/L，中國(guó)First Standard公司；

乙腈、丙酮：色譜純，美國(guó)Honeywell公司；

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-QP 2010 Ultra型，日本島津公司；

電子天平：CPA225D型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 樣品前處理方法

稱取樣品2.00 g，加入乙腈10.0 mL，超聲15 min后過濾至含有5 mL水和2 g氯化鈉的離心管中，漩渦振蕩后靜置5 min，分取5.00 mL乙腈上層液，80 ℃氮吹至干，1.00 mL丙酮復(fù)溶，過0.22 μm尼龍濾膜，備上機(jī)。外標(biāo)法定量。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 分別準(zhǔn)確量取美伐他汀、洛伐他汀及辛伐他汀儲(chǔ)備液(100 mg/L)各0.50 mL，合并后使用丙酮定容至10.0 mL容量瓶；混合標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為5 mg/L。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列 從5 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中分取10，50，100，500，1 000 μL；以丙酮分別定容至5.0 mL容量瓶；此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度為0.01，0.05，0.10，0.50，1.00 mg/L。

1.4 測(cè)定條件

1.4.1 色譜條件 進(jìn)樣口溫度270 ℃；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL；Rxi-5ms色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，柱溫：初溫100 ℃，保持2 min，然后以15 ℃/min升至295 ℃，保持2 min；載氣：氦氣(純度≥99.99%)；恒壓模式：120 kPa。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電離模式為電子轟擊源(EI)，能量為70 eV，離子源溫度220 ℃，接口溫度290 ℃；掃描方式：離子掃描(SIM)。主要色譜及質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評(píng)定公式

按式(1)計(jì)算合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

(1)

表1 保留時(shí)間及定量離子信息

式中：

uc——合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

按式(2)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

(2)

式中：

urel——相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

x——樣品質(zhì)量濃度測(cè)定值。

按式(3)計(jì)算擴(kuò)展不確定度。

U=kuc(x)，

(3)

式中：

U——擴(kuò)展不確定度；

k——常數(shù)(95%置信水平)，取2。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

(4)

式中：

ω——樣品中目標(biāo)物的含量，mg/kg；

C——樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度，mg/L；

V——定容體積，mL；

D——稀釋因子；

m——稱樣量，g；

frep——重復(fù)性引入的修正因子。

2.2 不確定度的來源分析

基于測(cè)定方法及數(shù)學(xué)模型，影響試驗(yàn)不確定度的主要分量為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、定容體積、稱樣量以及重復(fù)性等。影響各分量的因素詳見圖1。

圖1 不確定度來源分析圖

2.3 各不確定度分量的評(píng)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

(1) 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：依據(jù)各項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書所提供的擴(kuò)展不確定度U、包含因子k、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度值X等信息，以B類評(píng)定方法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C1)，見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度

(2) 配制過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：依據(jù)1.3步驟，標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制過程涉及10.0 mL容量瓶、500 μL移液器。試驗(yàn)使用的A級(jí)容量瓶所引入的不確定度由容量校準(zhǔn)不確定度u(C容A)、溫度效應(yīng)不確定度u(C容B)兩個(gè)分量組成；移液器引入的不確定度由容量校準(zhǔn)不確定度u(C移A)、溫度效應(yīng)不確定度u(C移B)兩個(gè)分量組成。

移液器引入的不確定度擬合方法與容量瓶一致。標(biāo)準(zhǔn)工作液使用的500 μL移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果見表3，為2.58×10-3。

表3 定量器具引入的不確定度

1.3.2步驟中逐級(jí)稀釋引入的不確定度可忽略不計(jì)。因此，按式(5)計(jì)算配制過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C2)：

(5)

計(jì)算結(jié)果為4.18×10-3。

(3) 樣品中目標(biāo)物濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：按式(6)計(jì)算目標(biāo)物濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)：

(6)

計(jì)算可得美伐他汀、洛伐他汀及辛伐他汀在標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的urel(C)分別為4.22×10-3，4.22×10-3，4.21×10-3。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 取1.3.2 配制的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別測(cè)定3次，以峰面積A為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度Ci為橫坐標(biāo)擬合線性方程，結(jié)果見表4。取樣品加標(biāo)后上機(jī)測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀他的濃度，按式(7)分別計(jì)算3種他汀類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度差的平方和：

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)?

(7)

式中：

Sxx——標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度差的平方和；

Ci——不同標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度值，mg/L；

按式(8)分別計(jì)算3種他汀類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差：

(8)

式中：

S——標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差；

Aj——標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積；

B0——標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；

B1——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

n——標(biāo)準(zhǔn)曲線中校準(zhǔn)點(diǎn)的測(cè)量次數(shù)，n=15。

將式(7)、式(8)計(jì)算所得結(jié)果帶入式(9)中計(jì)算3種他汀類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合所引入的不確定度：

(9)

式中：

u(curve)——標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度；

p——實(shí)際被測(cè)樣品的重復(fù)測(cè)量次數(shù)，p=2；

x——實(shí)際被測(cè)樣品的平均質(zhì)量濃度值，mg/L。

計(jì)算所得美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.48×10-2，1.54×10-2，2.77×10-2。

2.3.3 定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 從10.0 mL樣品的乙腈提取液中分取5.0 mL進(jìn)行凈化或濃縮處理，稀釋因子D為2；樣品提取液經(jīng)80 ℃氮吹至干后，準(zhǔn)確加入1.00 mL丙酮復(fù)溶。以上過程使用的是10,5 mL的單標(biāo)線吸量管及1 000 μL移液器，其引入的不確定度擬合計(jì)算方法與2.3.1(2)容量瓶一致，計(jì)算結(jié)果詳見表3。三者引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為2.51×10-3，2.68×10-3，2.58×10-3。按式(5)計(jì)算定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為4.49×10-3。

2.3.4 稱樣量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 稱樣量為2.00 g，依據(jù)JJG 1036—2008標(biāo)準(zhǔn)及該天平校準(zhǔn)證書可知，其偏載誤差為5.0×10-5g，k=2，則按式(10)計(jì)算稱樣量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(10)

式中：

d——偏載誤差，g；

k——常數(shù)(95%置信水平)，取2；

m——稱樣量，g。

計(jì)算結(jié)果為1.25×10-5。

2.3.5 重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 重復(fù)稱量同一陰性樣品11份，分別進(jìn)行0.10 mg/kg加標(biāo)，相同條件下進(jìn)行前處理并測(cè)定含量值。采用A類評(píng)定，按式(11)計(jì)算重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(11)

式中：

urel(ωi)——重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

S(ωi)——11份加標(biāo)樣品含量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，mg/kg；

e——加標(biāo)樣品的平行份數(shù)，e=11；

為考察水—氯化鈉凈化步驟對(duì)測(cè)定結(jié)果重復(fù)性的影響。重復(fù)稱量同一陰性樣品11份，分別進(jìn)行0.10 mg/kg洛伐他汀加標(biāo)試驗(yàn)。操作步驟不包括水—氯化鈉鹽析，其余步驟與1.2一致。11組樣品的測(cè)定結(jié)果分別為0.131 1，0.109 4，0.110 3，0.120 3，0.102 2，0.104 1，0.119 0，0.120 4，0.103 2，0.130 9，0.117 2 mg/kg。此時(shí)，重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(11)計(jì)算，結(jié)果為2.59×10-2。其他項(xiàng)目重復(fù)性的測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 各項(xiàng)目的重復(fù)性的測(cè)定結(jié)果

2.4 合成不確定度

匯總試驗(yàn)所用檢測(cè)方法涉及到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量，在此基礎(chǔ)上，擬合95%置信區(qū)間，包含因子k=2的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucrel(ω)、合成不確定度uc(ω)、擴(kuò)展不確定度U(ω)以及檢測(cè)結(jié)果ω見表6。

由表6可知，試驗(yàn)所用檢測(cè)方法對(duì)美伐他汀、洛伐他汀及辛伐他汀擬合的各不確定分量大小的趨勢(shì)一致，主要來源是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，其次是定容體積、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制以及重復(fù)性。通過對(duì)比樣品經(jīng)過水—氯化鈉凈化與否，得出洛伐他汀引入的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果：經(jīng)凈化后的值為3.12×10-3，未經(jīng)凈化后的值為2.59×10-2，前者約為后者的10%，與孫麗萍等[10]有關(guān)HPLC法測(cè)定保健食品中洛伐他汀含量的不確定度擬合分量結(jié)果一致，最后檢測(cè)結(jié)果表述為(0.99±0.06) mg/g (k=2)，擴(kuò)展不確定度與檢測(cè)值之比為6.06%。在孫麗萍[10]的研究中，不確定度的主要來源是重復(fù)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.023 3，占各不確定度分量和的54%，遠(yuǎn)超過試驗(yàn)方法擬合的重復(fù)性分量0.003 12以及對(duì)應(yīng)的占比5%。綜上，若保健食品樣品未經(jīng)凈化，樣品基質(zhì)干擾導(dǎo)致重復(fù)性引入大量的不確定度，對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性影響較大。試驗(yàn)所建立的前處理方法引入水—氯化鈉凈化步驟，有利于提高檢測(cè)結(jié)果的精密度。

表6 各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度匯總表

3 結(jié)論

對(duì)保健食品中他汀類藥物進(jìn)行GC-MS檢測(cè)時(shí)，采用水—氯化鈉凈化法前處理，能夠降低樣品基質(zhì)的干擾，減少重復(fù)性引入的不確定度，提高檢測(cè)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。重復(fù)性及樣品的稱取都會(huì)引入不確定度，但其主要來源于標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、定容體積以及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。因此，平時(shí)檢驗(yàn)檢測(cè)過程中要注意前處理的規(guī)范性，盡可能選用高精度以及經(jīng)校準(zhǔn)為A級(jí)量具配制溶液等。同時(shí)應(yīng)定期對(duì)GC-MS進(jìn)行期間核查以及檢定校準(zhǔn)，使用過程中關(guān)注儀器的狀態(tài)并做好維護(hù)，以保證測(cè)定結(jié)果的可靠性。