二氫楊梅素及其?；苌飳?duì)肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

杜寶雙 陳尚衛(wèi) 李 玥 朱 松

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

大部分的肝損傷疾病如肝硬化、肝纖維化等，都伴隨著由細(xì)胞氧化應(yīng)激以及脂質(zhì)過(guò)氧化[1]引起的肝細(xì)胞氧化損傷。

二氫楊梅素(DHM)是一種苷元類類黃酮化合物，主要來(lái)源于藥食同源植物顯齒蛇葡萄[2]，具有抗菌、抗氧化、抗炎、護(hù)肝、調(diào)節(jié)糖代謝等生物功能[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素可以通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化指標(biāo)和抗炎因子抑制氧化應(yīng)激從而減輕小鼠肝臟氧化損傷[5]，且在油酸誘導(dǎo)的L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞肝脂肪變性模型中，二氫楊梅素具有抑制細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)積累和氧化應(yīng)激的作用[6]。但由于二氫楊梅素親脂性差，在生物體系中不易透過(guò)脂質(zhì)雙分子層，使其轉(zhuǎn)運(yùn)吸收緩慢，限制了其在肝臟中的利用。

目前，可以通過(guò)?；揎椞岣逥HM的脂溶性，即選擇合適的酰基供體取代二氫楊梅素分子上對(duì)其活性影響較小的羥基基團(tuán)，進(jìn)而降低其極性[7]。其中，酶法?；浅Ｓ玫孽；椒?，該方法綠色環(huán)保、過(guò)程簡(jiǎn)單且選擇性高[8]。因此研究擬建立人正常肝細(xì)胞氧化損傷模型，通過(guò)酶法酰化修飾DHM得到不同親脂性的DHM衍生物，考察DHM及其衍生物對(duì)肝細(xì)胞氧化損傷模型的保護(hù)機(jī)制，以期為二氫楊梅素應(yīng)用于生物體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二氫楊梅素、槲皮素：純度>98%，合肥博美生物科技有限公司；

固定化脂肪酶(Lipozyme TL IM)：250 U/g，諾維信生物技術(shù)有限公司；

丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯和己酸乙烯酯：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；

30%過(guò)氧化氫(H2O2)、甲基叔丁基醚：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

PMSF蛋白酶抑制劑、ROS試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、Caspase 3活性檢測(cè)試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；

胎牛血清(FBS)、青霉素—鏈霉素雙抗(100×)、磷酸緩沖液(PBS)：Themo Fisher Scientific公司；

MTT試劑盒、LDH檢測(cè)試劑盒、BCA試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒、總SOD活性檢測(cè)試劑盒、CAT檢測(cè)試劑盒、GSH-PX檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

倒置熒光顯微鏡：ECLISE Ti2型，美國(guó)尼康公司；

高速冷凍離心機(jī)：Centrifuge 5415R型，德國(guó)艾本德公司；

雪花制冰機(jī)：FMB40型，無(wú)錫沃信有限公司；

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：Multiskan GO1510型，賽默飛科技有限公司；

磁力攪拌器：RET型，IKA公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DHM衍生物制備 在反應(yīng)瓶中依次加入10 mL甲基叔丁基醚，0.18 mmol DHM和0.4 U/mg DHM的固定化脂肪酶，再分別加入3.6 mmol不同碳鏈的脂肪酸乙烯酯，上述反應(yīng)體系在50 ℃、200 r/min下反應(yīng)72 h。然后分離純化樣品，冷凍干燥后得到5種3-O-酰化二氫楊梅素，分別為3-O-乙酰化二氫楊梅素(C2-DHM)、3-O-丁?；錀蠲匪?C4-DHM)、3-O-己?；錀蠲匪?C6-DHM)、3-O-辛?；錀蠲匪?C8-DHM)和3-O-月桂?；錀蠲匪?C12-DHM)。

1.3.2 H2O2損傷濃度確定 在96孔板中培養(yǎng)(7×103個(gè)/孔，100 μL)24 h，將細(xì)胞分成2組，一組加入100 μL 不完全培養(yǎng)基(含1%雙抗但不含F(xiàn)BS)，另一組加入100 μL含H2O2(200，300，400，500，600 μmol/L)的培養(yǎng)基。孵育4 h后，按照MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。選擇細(xì)胞存活率在50%左右的H2O2濃度構(gòu)建肝細(xì)胞氧化損傷模型。

1.3.3 肝細(xì)胞氧化損傷模型建立 將L02細(xì)胞分為損傷組、保護(hù)組和對(duì)照組，置于96孔板中培養(yǎng)(1×104個(gè)/孔，100 μL) 24 h。隨后往保護(hù)組加入100 μL含DHM或DHM衍生物(3.25，7.50，15.00，30.00 μmol/L)的培養(yǎng)基，對(duì)照組和損傷組中加入100 μL不完全培養(yǎng)基，孵育24 h。孵育結(jié)束后，保護(hù)組和損傷組中均加入100 μL含適宜損傷濃度H2O2的培養(yǎng)基，對(duì)照組中加入同等體積的不完全培養(yǎng)基，孵育4 h，按照MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞增值情況。選擇細(xì)胞存活率最高的樣品濃度作為最佳保護(hù)濃度。同時(shí)，選擇槲皮素做為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.4 DHM及其衍生物對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化損傷相關(guān)理化指標(biāo)的影響

(1) ROS、LDH、MDA、CAT、MDA、SOD和GSH-PX：在6孔板中培養(yǎng)L02細(xì)胞(3×105個(gè)/孔，2 mL) 24 h，保護(hù)組中加入2 mL含最佳濃度樣品的培養(yǎng)基，對(duì)照組和損傷組加入同等體積的不完全培養(yǎng)基，孵育24 h后，損傷組和保護(hù)組加入2 mL含H2O2(400 μmol/L)的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入同等體積的不完全培養(yǎng)基，再孵育4 h 后吸去上清，PBS清洗兩遍。按照相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)培養(yǎng)基中ROS、LDH、MDA、CAT、MDA、SOD和GSH-PX水平，用倒置熒光顯微鏡拍照。

(2) 線粒體膜電位：在6孔板中培養(yǎng)L02細(xì)胞(3×105個(gè)/孔，2 mL) 24 h，保護(hù)組中加入2 mL含最佳濃度樣品的培養(yǎng)基，損傷組和對(duì)照組中加入同等體積的不完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h后，保護(hù)組和損傷組中加入2 mL 含損傷濃度適宜的H2O2培養(yǎng)基，對(duì)照組中加入同等體積的不完全培養(yǎng)基，再孵育4 h后，加入含有1% PMSF的RIPA裂解液處理30 min，用移液槍吸取裂解液至離心管中，離心(15 000 r/min)得上清液。按照線粒體膜電位試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，使用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行拍照。

(3) Caspase 3：試驗(yàn)步驟參照1.2.4，并按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定Caspase 3相對(duì)活性水平。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 使用Microsoft Excel和Origin 2018處理數(shù)據(jù)和繪圖，并使用IBM SPSS Statistics 22進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)氧化氫損傷濃度

由圖1可知，在200～600 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，相同的孵育時(shí)間下，隨著H2O2濃度的增大，細(xì)胞存活率逐漸下降。一般情況下，選擇細(xì)胞存活率在50%左右的濃度或者孵育時(shí)間構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型[9]，因此，選擇濃度400 μmol/L的H2O2建模，在此濃度下孵育4 h細(xì)胞存活率約為45%。

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 DHM及其衍生物濃度對(duì)氧化損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用

由圖2可知，在3.25,7.50 μmol/L濃度下，DHM及其衍生物處理組的細(xì)胞存活率均低于槲皮素處理組；而在15,30 μmol/L濃度下，C8-DHM處理組的細(xì)胞存活率高于槲皮素處理組，而其他衍生物包括DHM處理組的細(xì)胞存活率低于槲皮素處理組，這表明，在此濃度下，C8-DHM對(duì)肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果高于槲皮素。在3.25～30.00 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，DHM及其衍生物處理組的細(xì)胞存活率均高于損傷組，且隨著濃度的增大，DHM和C2-DHM處理組的細(xì)胞存活率逐漸升高；其他衍生物處理組的細(xì)胞存活率則先升高后降低。在15 μmol/L時(shí)各組的細(xì)胞存活率最高，其中C8-DHM處理組的細(xì)胞存活率最高，達(dá)到了88.81%，即C8-DHM對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果最為明顯。隨著親脂性的提高，DHM衍生物更容易與細(xì)胞膜結(jié)合并穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)而參與到細(xì)胞內(nèi)的自由基產(chǎn)生的反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮活性，起到保護(hù)肝細(xì)胞、提高細(xì)胞活力的作用；而當(dāng)取代碳鏈達(dá)到一定長(zhǎng)度后，空間位阻增大，阻礙衍生物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部且限制其與自由基的接觸，從而影響了活性的發(fā)揮。

圖2 DHM及其衍生物對(duì)L02細(xì)胞氧化損傷模型的保護(hù)作用

2.3 DHM及其衍生物對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

采用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)ROS水平，以DCF熒光圖像中綠色強(qiáng)弱作為評(píng)判。熒光圖像中綠色熒光強(qiáng)度越弱表示ROS水平越低，反之則表示ROS水平越高[10]。熒光結(jié)果為對(duì)照組的圖像中幾乎無(wú)綠色熒光，而H2O2損傷組的綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，可見(jiàn)損傷組的細(xì)胞被H2O2刺激后產(chǎn)生并累積了過(guò)量的ROS；相較于損傷組，DHM及其衍生物處理組的熒光強(qiáng)度明顯減弱，表明DHM及其衍生物均能抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。當(dāng)取代碳鏈長(zhǎng)度從C0增加到C8時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度越來(lái)越弱，ROS水平逐漸降低；取代碳鏈長(zhǎng)度從C8增加到C12時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度稍有增強(qiáng)，ROS水平提高。

2.4 DHM及其衍生物對(duì)細(xì)胞LDH釋放的影響

由圖3可知，與損傷組相比，DHM及其衍生物處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH水平明顯下降(P<0.05)，且隨著取代碳鏈長(zhǎng)度的增長(zhǎng)，細(xì)胞胞外LDH的活性呈先降低后升高的趨勢(shì)，其中，C8-DHM處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性最低，降到了384.56 U/L。綜上，DHM及其衍生物可以通過(guò)保護(hù)細(xì)胞膜以提高細(xì)胞活力，其中，C8-DHM的效果最好。

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.5 DHM及其衍生物對(duì)MDA水平的影響

由圖4可知，與損傷組相比，DHM及其衍生物處理組的MDA水平顯著降低(P<0.05)，除C2-DHM處理組外，其余衍生物處理組的MDA水平均低于DHM處理組，可見(jiàn)，親脂性的提高可以使DHM更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)阻止過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生，從而避免細(xì)胞的損傷，其中C6-DHM和C8-DHM的效果最好。

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.6 DHM及其衍生物對(duì)細(xì)胞中抗氧化酶系的影響

由圖5可知，相較于H2O2損傷組，DHM及其衍生物處理組的SOD、GSH-PX和CAT活力均有所提高；衍生物處理組中，除C12-DHM外，其余衍生處理組的3種抗氧化酶的活力均高于DHM處理組?？傮w上看，隨著取代碳鏈的延長(zhǎng)，3種抗氧化酶的活力呈先升高后降低的趨勢(shì)，C8-DHM對(duì)3種抗氧化酶活力的提高效果最為明顯。因此，DHM及其衍生物對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的清除能力與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系有關(guān)，而親脂性一定程度的提高有利于DHM進(jìn)入細(xì)胞上調(diào)相關(guān)的抗氧化酶活力。

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.7 DHM及其衍生物對(duì)線粒體膜電位的影響

通過(guò)JC-1熒光探針檢測(cè)的紅綠熒光變化可評(píng)估線粒體膜電位的下降程度。由熒光結(jié)果可知，相比于對(duì)照組，損傷組基本上整體呈現(xiàn)綠色熒光，表明其線粒體膜電位顯著降低；相較于損傷組，DHM及其衍生物組的紅色熒光程度增強(qiáng)，而且衍生物處理組的紅色熒光程度高于DHM處理組，表明DHM及其衍生物能夠抑制線粒體膜電位的下降，且衍生物組的細(xì)胞線粒體膜電位高于DHM處理組，其中，經(jīng)C8-DHM處理的細(xì)胞圖像中幾乎無(wú)綠色熒光，表明其能顯著抑制線粒體膜電位的下降，從而阻止早期的細(xì)胞凋亡。

2.8 DHM及其衍生物對(duì)Caspase 3水平的影響

由圖6可知，Caspase活性相對(duì)水平依次為對(duì)照組≈DHM處理組>C2-DHM處理組>C12-DHM處理組>C4-DHM處理組>C6-DHM處理組≈C8-DHM處理組>空白組，5種衍生物處理組的Caspase 3相對(duì)活性水平顯著低于DHM處理組，其中C6-DHM和C8-DHM處理組的Caspase 3相對(duì)活性水平最低，表明中等鏈長(zhǎng)的親脂性衍生物可顯著增強(qiáng)DHM抑制Caspase 3活性的能力。

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

通過(guò)構(gòu)建L02細(xì)胞過(guò)氧化氫損傷模型，考察了二氫楊梅素及其衍生物對(duì)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)效果。除3-O-月桂?；錀蠲匪?C12-DHM)外，其余衍生物處理組對(duì)L02細(xì)胞的保護(hù)作用均高于DHM，DHM衍生物能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化通路減少活性氧的產(chǎn)生和積累，其中3-O-辛?；錀蠲匪?C8-DHM)對(duì)L02細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果最為顯著。關(guān)于二氫楊梅素及其衍生物對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制只探討了線粒體通路中的關(guān)鍵位點(diǎn)，接下來(lái)會(huì)進(jìn)一步考察對(duì)其他通路如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、死亡受體通路等的影響。