圓柏葉揮發(fā)性成分夏初的日變化規(guī)律

路 通，田旭平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西太谷 030801）

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)實(shí)力的提高，人們對(duì)健康生活的需求日益增長(zhǎng)，生態(tài)文明建設(shè)成為我國(guó)未來(lái)發(fā)展的重點(diǎn)。在此背景下，以休閑娛樂(lè)、養(yǎng)生保健為主題的森林康養(yǎng)理念開(kāi)始深入人心[1]。植物通過(guò)葉片或花等器官合成并釋放揮發(fā)性有機(jī)物[2]（Volatile organic compounds，VOCs），該類物質(zhì)有助于營(yíng)造出負(fù)氧離子含量高和空氣細(xì)菌含量低的森林空間。能釋放VOCs 的樹(shù)木是森林康養(yǎng)重要的保健資源[3]。植物VOCs 是一類次生代謝產(chǎn)物，包含萜類、醇類、酯類、醛類、酮類、烷烴類、芳香烴類和有機(jī)酸類等物質(zhì)[4]。一定濃度的植物VOCs 具有殺菌消毒和抗病毒感染等作用，有助于人們鎮(zhèn)靜放松和提高人體免疫力等[5]，但濃度過(guò)高會(huì)使人產(chǎn)生緊張和焦慮等情緒[6]。

圓柏（Sabina chinensis）是中國(guó)傳統(tǒng)園林綠化樹(shù)種，其釋放的VOCs 殺菌保健能力較強(qiáng)[7]。寧平等[8]發(fā)現(xiàn)，4 — 5月，圓柏一日內(nèi)釋放的VOCs 含量與溫度呈顯著正相關(guān)，24 ～35 ℃時(shí)VOCs 釋放量最大。楊佳楠[9]發(fā)現(xiàn)，圓柏VOCs 成分中，烯烴類、烷烴類、酯類、醇類、酮類、醛類和酸類物質(zhì)相對(duì)含量的日變化規(guī)律不同。蓋苗苗[10]和高巖[6]分別采用頂空固相微萃取法（Headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和活體植物頂空套袋采集法對(duì)圓柏VOCs 的組成和釋放規(guī)律進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)圓柏VOCs的主要成分為烷烴和萜烯類化合物，7月的釋放強(qiáng)度最大。這些研究采用面積歸一化法計(jì)算圓柏VOCs 成分的相對(duì)含量，葉內(nèi)VOCs 成分含量的變化不清晰。植物VOCs 的成分及含量受溫度、光照和空氣濕度等環(huán)境和氣候因素的影響，呈現(xiàn)年變化和日變化[11-12]。為了解晉中地區(qū)圓柏葉一日內(nèi)VOCs成分和含量的變化規(guī)律，本研究采用頂空固相微萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對(duì)圓柏葉VOCs 成分和含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，揭示和完善圓柏葉VOCs 夏初的日變化規(guī)律，豐富圓柏?fù)]發(fā)物研究，為圓柏在森林康養(yǎng)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)（112°58′E，37°42′N）樹(shù)齡相同、長(zhǎng)勢(shì)相似的3 株成年健康圓柏雌株。2021年5月中旬，選擇晴朗無(wú)風(fēng)的3天，7:00、10:00、13:00、16:00 和19:00 時(shí)，分別從3 株圓柏上剪取向陽(yáng)面生長(zhǎng)、約30 cm 長(zhǎng)的枝條，采集枝條上完整的成熟刺葉，混合后檢測(cè)。樣品隨采隨測(cè)，當(dāng)天每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)1次，連續(xù)測(cè)3天。

參考國(guó)家氣象科學(xué)數(shù)據(jù)共享服務(wù)平臺(tái)（http://data.cma.cn/site/index.html）的數(shù)據(jù)信息，試驗(yàn)地5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的氣溫分別為（10 ± 2）、（13 ± 2）、（19 ± 2）、（25±2）和（17±2）℃。

1.2 試劑與儀器

色譜純正己烷（C6H14，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；色譜純正十六烷（C16H34，上海源葉生物科技有限公司）。

Triplus RSH自動(dòng)進(jìn)樣器；Trace 1300氣相色譜儀；TraceISQ質(zhì)譜分析儀（美國(guó)Thermo公司）；DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭（50/30μm，美國(guó)Supelco 公司）；TP-114電子天平（丹佛儀器（北京）有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 頂空固相微萃取法

稱取0.5 g 混合圓柏刺葉，用超純水將其沖洗干凈并吸干水分，放入20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入5μL正己烷稀釋過(guò)的正十六烷內(nèi)標(biāo)溶液(10-4g/mL) ，旋緊瓶蓋。萃取條件設(shè)置為50 ℃恒溫，吸附時(shí)間40 min，平衡時(shí)間20 min，解析時(shí)間5 min。

1.3.2 氣相色譜條件

色譜柱DA-5MS（30 m × 0.25 mm（ID）× 0.25μm）；程序升溫為初始溫度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 速率升溫至150 ℃，保持5 min，以10 ℃/min速率升溫至230 ℃，保持2 min；載氣為高純He（99.999%）；流速為1 mL/min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度為250 ℃。

1.3.3 質(zhì)譜條件

傳輸線溫度為280 ℃；EI 離子源溫度為280 ℃；電子轟擊能量為70 eV；全掃描范圍為45 ～500 m/z；溶劑延遲時(shí)間為5 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 定性定量分析

采用NIST08譜庫(kù)檢索及人工圖譜，根據(jù)匹配度和保留指數(shù)等進(jìn)行解析，定性圓柏葉揮發(fā)物的組分。以正十六烷為內(nèi)標(biāo)物，采用單點(diǎn)內(nèi)標(biāo)法定量各組分的含量。計(jì)算公式為[13]：

Cx=C0×Sx/S0

式中，Cx為目標(biāo)物含量（μg/g）；C0為內(nèi)標(biāo)物含量（μg/g）；Sx為目標(biāo)物峰面積；S0為內(nèi)標(biāo)物峰面積。

1.4.2 統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖；表中物質(zhì)含量均為（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）。

2 結(jié)果與分析

2.1 圓柏葉VOCs成分及含量

共鑒定出67 種VOCs 成分，7:00、10:00、13:00、16:00 和19:00 分別鑒定出56、63、64、65 和61 種；10:00 ～16:00 種類較多，7:00 最少；相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)萃取的VOCs總含量分別為6.901、13.033、11.081、8.960和5.570μg/g，隨時(shí)間推移呈“單峰”曲線變化，10:00 時(shí)含量最高，19:00 時(shí)最低（表1 ～2）。鑒定出的VOCs 成分分別屬于萜類、苯環(huán)類、醇類、酯類、酮類、醛類及酸酐類物質(zhì)。5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)萜類物質(zhì)的數(shù)量均最多，含量均占VOCs總含量的88%以上；10:00時(shí)測(cè)出的VOCs 中，含量高于1μg/g 的萜類物質(zhì)有3種，分別為檜烯、β-羅勒烯和L-乙酸龍腦酯，這些成分的含量之和占10:00 時(shí)VOCs 總含量的31.46%。苯環(huán)類物質(zhì)含量在7:00、16:00和10:00時(shí)較高；醇類物質(zhì)含量在10:00 和13:00 時(shí)較高；酯類物質(zhì)含量在10:00時(shí)最高。同一樣品體系中，萜類物質(zhì)的數(shù)量和含量均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其他類型物質(zhì)的含量隨時(shí)間變化表現(xiàn)不一。

表1 圓柏葉VOCs各組分?jǐn)?shù)量Tab.1 Numbers of VOCs in S.chinensis leaves

2.2 圓柏葉VOCs成分日動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 萜類物質(zhì)含量日變化

各時(shí)間點(diǎn)萜類物質(zhì)的總含量為5.209 ～11.599μg/g，10:00 時(shí)最高，呈“單峰”曲線變化，與VOCs 總含量的變化趨勢(shì)一致（表2）。共鑒定出46種萜類物質(zhì)，37 種在5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)均被檢測(cè)到（圖1）。37 種物質(zhì)中，含量呈“單峰”曲線變化的有24 種，分別為檜烯、β-羅勒烯、D-大根香葉烯、β-月桂烯、D-檸檬烯、δ-杜松烯、β-側(cè)柏烯、γ-松油烯、(R)-α-蒎烯、石竹烯、γ-依蘭油烯、α-畢橙茄油烯、α-異松油烯、γ-杜松烯、α-依蘭油烯、β-畢橙茄油烯、（+）表雙環(huán)倍半水芹烯、4-萜烯醇、3-甲基樟腦醇、龍腦、蛇麻烯、β-欖香烯、波斯菊萜和衣蘭烯，與萜類物質(zhì)總含量的變化趨勢(shì)一致；含量呈“M”型曲線變化的有6 種，分別為L(zhǎng)-乙酸龍腦酯、α-古巴烯、(S)-(-)-香茅酸甲酯、三環(huán)烯、莰烯和香葉酸甲酯，這些成分的含量分別在10:00 和16:00 時(shí)出現(xiàn)高峰；含量呈倒“N”型曲線變化的有4 種，分別為順式-β-松油醇、左旋樟腦、α-松油醇和D-大根香葉醇，這些物質(zhì)的含量7:00 ～10:00 時(shí)下降，10:00 ～13:00 時(shí)上升，13:00 時(shí)后下降；含量呈“V”型曲線變化的僅有β-波旁烯1種，含量從7:00 時(shí)開(kāi)始下降，16:00 時(shí)最低，之后上升；含量呈“斜線”下降的僅有(-)-α-側(cè)柏酮1 種，呈持續(xù)下降狀態(tài)；含量呈“W”型曲線變化的僅有2,4-側(cè)柏二烯1 種，含量分別在10:00 和16:00 時(shí)出現(xiàn)低谷，7:00、13:00 和19:00 時(shí)較高。9 種物質(zhì)在5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有被全部檢測(cè)到；α-水芹烯僅在7:00 時(shí)被檢測(cè)到；芳樟醇、順式-3,5-依蘭油二烯、胡椒酮、1,4-杜松二烯和β-衣蘭烯這5 種物質(zhì)在7:00 時(shí)未被檢測(cè)到，其他時(shí)間點(diǎn)均被檢測(cè)到；別羅勒烯在7:00 和19:00 時(shí)未被檢測(cè)到，其他時(shí)間點(diǎn)均被檢測(cè)到；α-法尼烯在13:00 和19:00 時(shí)未被檢測(cè)到，其他時(shí)間點(diǎn)均被檢測(cè)到；乙酸4-松油酯僅在16:00 和19:00 時(shí)被檢測(cè)到；含量呈“單峰”曲線變化的有芳樟醇，呈下降趨勢(shì)的有別羅勒烯、胡椒酮、1,4-杜松二烯和β-衣蘭烯，呈倒“N”型曲線變化的有順式-3,5-依蘭油二烯。

表2 圓柏葉VOCs各組分的含量Tab.2 Contents of VOCs in S.chinensis leaves (μg/g)

圖1 圓柏葉VOCs各萜類物質(zhì)的含量Fig.1 Contents of terpenoids in VOCs of S.chinensis leaves

2.2.2 苯環(huán)類物質(zhì)含量日變化

各時(shí)間點(diǎn)苯環(huán)類物質(zhì)的總含量為0.139 ～0.301μg/g，呈倒“N”型曲線變化，7:00時(shí)最高，7:00 ～13:00時(shí)下降，13:00 ～16:00 時(shí)上升，19:00 時(shí)最低（表2）。共鑒定出5 種苯環(huán)類物質(zhì)，僅對(duì)二甲苯在7:00 時(shí)未被檢測(cè)到，其他4種物質(zhì)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均被檢測(cè)到，表明苯環(huán)類物質(zhì)為圓柏葉VOCs 的穩(wěn)定成分（圖2）。順式-3-己烯醇苯甲酸酯和鄰傘花烴的含量與苯環(huán)類物質(zhì)總含量的變化趨勢(shì)一致；鄰甲氧基苯甲酸甲酯和對(duì)二甲苯的含量呈“單峰”型曲線變化；4-烯丙基苯甲醚呈“M”型曲線變化。5 種物質(zhì)含量的變化曲線不一致。

圖2 圓柏葉VOCs各苯環(huán)類物質(zhì)的含量Fig.2 Contents of benzenes in VOCs of S.chinensis leaves

2.2.3 醇類物質(zhì)含量日變化

各時(shí)間點(diǎn)醇類物質(zhì)的總含量為0.102 ～0.211μg/g，10:00 時(shí)最高，呈“單峰”曲線變化，與VOCs 總含量的變化趨勢(shì)一致（表2）。共鑒定出6 種醇類物質(zhì)；順-3-己烯-1-醇和1-辛烯-3-醇在5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)均被檢測(cè)到；2-壬醇在19:00 時(shí)未被檢測(cè)到，其他時(shí)間點(diǎn)均被檢測(cè)到；反式-4-(異丙基)-1-甲基環(huán)己-2-烯-1-醇在10:00 和13:00 時(shí)未被檢測(cè)到，其他時(shí)間點(diǎn)均被檢測(cè)到；3-己醇和2-己醇在7:00 和10:00 時(shí)未被檢測(cè)到，其他時(shí)間點(diǎn)均被檢測(cè)到；順-3-己烯-1-醇和1-辛烯-3-醇含量均呈“單峰”曲線變化，與醇類物質(zhì)總含量的變化趨勢(shì)一致（圖3）。

圖3 圓柏葉VOCs各醇類物質(zhì)的含量Fig.3 Contents of alcohols in VOCs of S.chinensis leaves

2.2.4 酯類物質(zhì)含量日變化

各時(shí)間點(diǎn)酯類物質(zhì)的總含量為0.084 ～0.707μg/g，呈“M”型曲線變化；7:00 ～10:00 時(shí)上升，10:00時(shí)達(dá)到最高值，10:00 ～13:00 時(shí)下降，13:00 ～16:00時(shí)上升，16:00 時(shí)出現(xiàn)第2 個(gè)小高峰，19:00 時(shí)最低（表2）。共鑒定出7 種酯類物質(zhì)，這些物質(zhì)在5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)均被檢測(cè)到，表明這7 種物質(zhì)在圓柏葉的次生代謝過(guò)程中較穩(wěn)定；2,4-葵二烯酸甲酯、己酸4-戊烯基酯、順-3-己烯基丁酯和Z-3-甲基丁酸-3-己烯酯4 種物質(zhì)的含量均呈“M”型曲線變化，與酯類物質(zhì)總含量的變化趨勢(shì)一致；3-甲基-3-烯基-2-甲基丁酸酯和丁酸，4-戊烯基酯的含量均在10:00 時(shí)最高，呈“單峰”曲線變化；癸酸甲酯的含量呈下降趨勢(shì)（圖4）。

圖4 圓柏葉VOCs各酯類物質(zhì)的含量Fig.4 Content of esters in VOCs of S.chinensis leaves

2.2.5 其他物質(zhì)含量日變化

酮類、醛類和酸酐類物質(zhì)各檢測(cè)到1種；2-壬酮和癸醛在5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)均被檢測(cè)到，異丁酸酐在13:00和19:00 時(shí)未被檢測(cè)到（表1）。各時(shí)間點(diǎn)2-壬酮的含量為0.008 ～0.077μg/g，10:00 時(shí)最高，19:00 時(shí)最低，呈“單峰”曲線變化；各時(shí)間點(diǎn)癸醛的含量為0.017 ～0.039 μg/g，10:00 和16:00 時(shí)較低，呈“W”型曲線變化。

3 討論與結(jié)論

5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到的萜類物質(zhì)數(shù)量和含量在各時(shí)間點(diǎn)圓柏葉VOCs 中均最高，與其他關(guān)于圓柏葉揮發(fā)性成分的研究結(jié)果一致[14-15]。高巖[6]和楊佳楠[9]采用活體植物頂空套袋采集法研究圓柏葉揮發(fā)物，本研究采用頂空固相微萃取法，雖然采樣方法有差異，但對(duì)萜類物質(zhì)成分及含量的分析具有一致性，表明在研究圓柏葉揮發(fā)物動(dòng)態(tài)變化時(shí)，采用頂空固相微萃取法是可行的。與頂空套袋采集法相比，頂空固相微萃取法具有靈敏性高、重現(xiàn)性好、無(wú)需熔劑和容易定量等優(yōu)點(diǎn)，更適合在近自然狀態(tài)下對(duì)VOCs進(jìn)行采集和分析[16]。

李娟等[17]和謝小洋等[18]發(fā)現(xiàn)，夏季針葉樹(shù)VOCs濃度與日內(nèi)溫度和光照的變化呈顯著相關(guān)；早上，隨溫度升高和光照增強(qiáng)，VOCs濃度升高；11:00 ～13:00時(shí)，溫度和光照達(dá)到一天最大值，VOCs 釋放濃度的峰值出現(xiàn)在中午前后，下午開(kāi)始下降。本研究中，圓柏葉內(nèi)VOCs 總含量的日變化也表現(xiàn)為“單峰”型，10:00 時(shí)出現(xiàn)高峰，11:00 ～13:00 時(shí)含量的具體變化，需在后續(xù)工作中進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，萜類物質(zhì)含量的變化趨勢(shì)與圓柏葉VOCs 總含量一致，其數(shù)量及含量均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，萜類物質(zhì)的合成與代謝是影響圓柏葉VOCs 成分及含量的主要因素。影響植物合成和釋放萜類物質(zhì)的非生物因子主要有光照、溫度、水分、營(yíng)養(yǎng)、CO2濃度和空氣濕度等[6]。光是植物生長(zhǎng)發(fā)育的能量來(lái)源，在適宜范圍內(nèi)，光照增強(qiáng)有利于植物同化產(chǎn)物的積累，促進(jìn)植物VOCs 的合成，提高VOCs 合成途徑中相關(guān)萜類基因的表達(dá)量[19]。萜類物質(zhì)的合成、積累與釋放是通過(guò)一系列酶促反應(yīng)表現(xiàn)的生理活動(dòng)，適宜的溫度可促進(jìn)光合作用，提供碳源，增強(qiáng)代謝能力和關(guān)鍵酶的活性[20]。上午時(shí)，隨溫度升高和光照增強(qiáng)，植物的生理代謝逐漸增強(qiáng)，產(chǎn)生的萜類物質(zhì)逐漸增多；但萜類物質(zhì)合成后并未立即釋放，而是暫時(shí)貯存在植物體內(nèi)的特定結(jié)構(gòu)中，直至貯存氣體累積到一定量，貯存結(jié)構(gòu)內(nèi)部氣壓高于飽和蒸汽壓時(shí)，通過(guò)開(kāi)放的氣孔大量釋放出來(lái)[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，7:00 ～10:00 時(shí)，圓柏葉內(nèi)萜類物質(zhì)的含量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，表明萜類物質(zhì)合成后并未大量釋放，而是一直處于積累狀態(tài)；10:00時(shí)后，隨溫度繼續(xù)升高，萜類物質(zhì)的不斷合成與積累使得貯存結(jié)構(gòu)內(nèi)部氣壓逐漸高于飽和蒸汽壓，再加上氣孔導(dǎo)度增大[23]，圓柏VOCs 的釋放速率開(kāi)始高于合成速率[24]，其葉內(nèi)VOCs的含量逐漸下降。檜烯、β-羅勒烯和D-大根香葉烯等萜類物質(zhì)的含量均在10:00 時(shí)隨溫度升高達(dá)到高峰，有些萜類物質(zhì)沒(méi)有遵循上述規(guī)律，可能與這些化合物的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)[25]。

植物VOCs 是由多種化合物組成的復(fù)雜混合物，化合物的組成和含量具有多樣性、復(fù)雜性和時(shí)間上的動(dòng)態(tài)性[26]，醇、酯、醛、酮和苯環(huán)類化合物的合成受外界環(huán)境的影響顯著[2，27-28]，被釋放到環(huán)境中的含量存在差異[29]，這些物質(zhì)的合成與釋放機(jī)理影響著VOCs的日變化規(guī)律，對(duì)其機(jī)理需進(jìn)一步研究。

本研究采用固相微萃取法，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到的揮發(fā)物含量表示的是圓柏葉內(nèi)儲(chǔ)存的物質(zhì)含量，其在環(huán)境中的釋放效能受環(huán)境及化合物性質(zhì)的影響，其釋放到空氣中多呈微量或痕量[17]，對(duì)本研究中檢測(cè)到的微量及在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)未被檢測(cè)到的成分還需繼續(xù)深入研究。