電針誘導(dǎo)沉默信息調(diào)節(jié)因子1依賴性自噬對(duì)小鼠腦卒中后中樞性痛的影響

陸大浩, 高 巨, 黃天豐, 張 揚(yáng), 王驍穎

(揚(yáng)州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院 麻醉科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

腦卒中后中樞性痛(CPSP)是腦出血性或缺血性損傷后出現(xiàn)的神經(jīng)性疼痛綜合征[1], 主要表現(xiàn)為腦損傷區(qū)域相應(yīng)軀體部位的持續(xù)性或間歇性疼痛。CPSP為腦卒中后常見(jiàn)并發(fā)癥, 12%～18%的腦卒中患者會(huì)發(fā)生CPSP[2]。電針是將電學(xué)與針灸相結(jié)合的一種治療方法，臨床研究[3]發(fā)現(xiàn)電針可用于CPSP的治療，但其機(jī)制尚未闡明。自噬是細(xì)胞通過(guò)溶酶體降解并回收細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器或蛋白質(zhì)的過(guò)程，相關(guān)研究[4-5]表明，提高自噬水平可改善多種腦卒中后并發(fā)癥。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的蛋白去乙?；?，其活性上調(diào)及表達(dá)增加可促進(jìn)腦神經(jīng)細(xì)胞自噬，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮保護(hù)作用[6]。本研究通過(guò)建立小鼠CPSP模型，探討電針在CPSP中的作用及其與SIRT1、自噬的關(guān)系，以期為CPSP的臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取40只無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)健康雄性ICR小鼠作為研究對(duì)象, 8周齡，體質(zhì)量25～30 g, 購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號(hào)為SYXK(蘇)2017-0044。將小鼠分籠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)3 d, 隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、CPSP組、CPSP+電針組(EA組)和CPSP+電針+SIRT1抑制劑EX527組(EA+EX527組)，每組10只。

1.2 儀器與試劑

華佗牌SDZ-Ⅱ型電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，Ⅳ型膠原酶(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司), von-Frey纖毛(美國(guó)Stoelting公司)，熱輻射測(cè)痛儀(美國(guó)IITC公司), SIRT1兔單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司), Beclin-1兔單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司), p62兔單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司), GAPDH兔單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.3 CPSP模型建立

將小鼠分籠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)3 d, 參照文獻(xiàn)[7]方法建立CPSP模型。腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠并固定于腦立體定位儀上，剪去顱頂毛發(fā)，切開(kāi)頭皮暴露矢狀縫及前囟。參考小鼠腦立體定位圖譜，于小鼠右側(cè)丘腦腹后外側(cè)核(前囟后0.82～2.30 mm, 矢狀縫右側(cè)1.30～1.95 mm, 顱骨下3.01～4.25 mm)注射Ⅳ型膠原酶(Ⅳ型膠原酶0.01 U溶于10 nL生理鹽水)，隨后縫合切口并消毒皮膚。Sham組則注入等量無(wú)菌生理鹽水。

1.4 電針治療

模型建立完成24 h后，采用固定器將EA組小鼠固定，參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》取人中及雙側(cè)三陰交、內(nèi)關(guān)穴，針刺深度2 mm, 將針柄與電針儀連接進(jìn)行電針治療(疏密波，頻率2 Hz/15 Hz, 強(qiáng)度1 mA), 30 min/次, 1次/d, 持續(xù)14 d。EA+EX527組小鼠于每日電針治療前30 min腹腔注射5 mg/kg EX527, 其他操作與EA組相同。CPSP組和Sham組小鼠每日僅固定30 min, 無(wú)其他處理。

1.5 疼痛行為學(xué)測(cè)定

于CPSP模型建立前1 d(T0)和模型建立后3 (T1)、7 (T2)、14 d(T3)分別測(cè)定各組小鼠的機(jī)械縮足頻率(PWF)、熱縮足潛伏期(TWL)和冷縮足潛伏期(CWL)。① PWF測(cè)定: 選擇0.07 g規(guī)格的von-Frey纖毛進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定前將小鼠置入底部為金屬網(wǎng)架的透明玻璃罩內(nèi)適應(yīng)30 min, 然后使用von-Frey纖毛垂直、緩慢地刺向小鼠左后爪的足底中央部位，每次刺激1～2 s, 相鄰刺激時(shí)間間隔為10～15 s。若小鼠出現(xiàn)舔足或縮足反應(yīng)則視為陽(yáng)性，重復(fù)刺激小鼠左后爪10次，陽(yáng)性反應(yīng)次數(shù)占全部刺激次數(shù)的百分比即為PWF。② TWL測(cè)定: 采用熱輻射測(cè)痛儀進(jìn)行測(cè)定。將小鼠置入底部為透明玻璃板的透明玻璃罩內(nèi)適應(yīng)30 min, 使用熱輻射測(cè)痛儀照射小鼠左后爪的足底中央部位，當(dāng)小鼠出現(xiàn)舔足或縮足反應(yīng)時(shí)立刻停止照射并記錄相應(yīng)時(shí)間，重復(fù)測(cè)定5次，每次間隔5 min, 計(jì)算5次時(shí)間的平均值即為TWL。③ CWL測(cè)定: 采用冷鋁板進(jìn)行測(cè)定。將鋁板至于冰盒的冰面上，連續(xù)測(cè)定其溫度。當(dāng)鋁板溫度測(cè)定為0 ℃時(shí)，將小鼠置于板上。當(dāng)小鼠左后足出現(xiàn)舔足或縮足時(shí)立刻記錄時(shí)間，重復(fù)測(cè)定3次，每次間隔10 min, 計(jì)算3次時(shí)間的平均值即為CWL。

1.6 腦組織含水量測(cè)定

模型建立后第14天完成疼痛行為測(cè)試后，每組取5只小鼠，予3%戊巴比妥腹腔注射麻醉，迅速斷頭并將腦組織取出，去除腦干、小腦、嗅球及腦組織表面的腦膜和血塊后，使用濾紙將表面水分吸干。取右側(cè)大腦半球稱得濕質(zhì)量，然后置于80℃烘干箱內(nèi)烘干72 h后稱得干質(zhì)量。腦組織含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)腦組織中

SIRT1、Beclin-1、p62蛋白表達(dá)水平疼痛行為學(xué)測(cè)試完成后，將每組另外5只小鼠麻醉并斷頭取出腦組織，取損傷腦組織前后各2 mm范圍內(nèi)的組織塊，稱重后加入組織裂解液及蛋白酶抑制劑并勻漿，靜置于冰面30 min后移入離心管內(nèi)，于4 ℃下以12 000轉(zhuǎn)/min離心15 min, 離心半徑8 cm, 棄沉淀取上清液，采用二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離并電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。于室溫下用5%脫脂牛奶封閉1.5 h后，用TBST緩沖液洗膜3次, 10 min/次。分別加入SIRT1兔單克隆抗體(1∶1 000)、Beclin-1兔單克隆抗體(1∶1 000)、p62兔單克隆抗體(1∶1 000)、GAPDH兔單克隆抗體(1∶5 000), 4 ℃過(guò)夜。用TBST緩沖液洗膜3次, 10 min/次，然后將PVDF膜分別放入相應(yīng)的山羊抗兔IgG二抗(1∶3 000)室溫下孵育2 h, 用TBST緩沖液洗膜3次, 8 min/次。電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影曝光后，通過(guò)Image J圖像分析軟件計(jì)算目標(biāo)蛋白條帶灰度值，并用其與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠PWF比較

T0時(shí)，各組小鼠PWF比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); T1、T2、T3時(shí), CPSP組、EA組和EA+EX527組小鼠PWF均高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); EA組小鼠T1時(shí)PWF與CPSP組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，T2、T3時(shí)PWF低于CPSP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); EA+EX527組小鼠T1時(shí)PWF與EA組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), T2、T3時(shí)PWF高于EA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)機(jī)械縮足頻率比較 %

2.2 各組小鼠TWL比較

T0時(shí)，各組小鼠TWL比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); T1、T2、T3時(shí)，CPSP組、EA組和EA+EX527組小鼠TWL均短于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); EA組小鼠T1時(shí)TWL與CPSP組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), T2、T3時(shí)TWL長(zhǎng)于CPSP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); EA+EX527組小鼠T1時(shí)TWL與EA組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), T2、T3時(shí)TWL短于EA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)熱縮足潛伏期比較 s

2.3 各組小鼠CWL比較

T0時(shí)，各組小鼠CWL比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); T1、T2、T3時(shí), CPSP組、EA組和EA+EX527組小鼠CWL均短于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); EA組小鼠T1時(shí)CWL與CPSP組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), T2、T3時(shí)CWL長(zhǎng)于CPSP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); EA+EX527組小鼠T1時(shí)CWL與EA組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), T2、T3時(shí)CWL短于EA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)冷縮足潛伏期比較 s

2.4 各組小鼠腦組織含水量比較

CPSP組、EA組和EA+EX527組小鼠腦組織含水量均高于Sham組, EA組小鼠腦組織含水量低于CPSP組, EA+EX527組小鼠腦組織含水量高于EA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠腦組織含水量比較 %

2.5 各組小鼠腦組織SIRT1、Beclin-1、p62蛋白表達(dá)水平

與Sham組比較, CPSP組、EA組和EA+EX527組小鼠腦組織SIRT1、Beclin-1表達(dá)下調(diào), p62表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與CPSP組比較, EA組小鼠腦組織SIRT1、Beclin-1表達(dá)上調(diào), p62表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與EA組比較, EA+EX527組小鼠腦組織SIRT1、Beclin-1表達(dá)下調(diào), p62表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5、圖1。

表5 各組小鼠腦組織SIRT1、Beclin-1和p62表達(dá)量比較

圖1 各組小鼠腦組織SIRT1、Beclin-1和p62蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

CPSP為腦卒中后最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，發(fā)生率可達(dá)30%左右[8]。由于發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明, CPSP的靶向治療發(fā)展緩慢。目前臨床治療CPSP仍以藥物治療方法為主[9], 但長(zhǎng)期藥物治療易導(dǎo)致耐藥及多種不良反應(yīng)。電針具有操作方便、費(fèi)用低、毒副作用小等優(yōu)勢(shì)，在腦卒中的治療中越來(lái)越受到重視。研究[10]顯示，電針治療后，缺血性腦卒中大鼠腦組織中自噬水平升高，腦梗死體積縮小，神經(jīng)功能缺損程度減輕。有研究[11]提出，在出血性腦卒中大鼠模型中，電針治療同樣可提升腦組織中自噬水平而發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)，且電針的保護(hù)作用可被自噬抑制劑逆轉(zhuǎn)。然而，電針對(duì)CPSP的治療作用是否與自噬相關(guān)及其調(diào)控機(jī)制目前尚無(wú)定論。鑒于此，本研究參照文獻(xiàn)[7]建立小鼠CPSP模型，探討電針是否通過(guò)調(diào)控SIRT1介導(dǎo)的自噬參與CPSP的發(fā)生發(fā)展，模型建立后, CPSP組小鼠痛閾值降低、腦組織含水量增加，表明造模成功。

自噬為真核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)容物降解及再循環(huán)的主要方式，對(duì)于維持細(xì)胞的正常功能、生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義[12]。Beclin-1是一種重要的自噬調(diào)控因子，可作為支架蛋白與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)形成復(fù)合物，并促進(jìn)自噬體形成，在自噬起始階段發(fā)揮主導(dǎo)作用[13]。p62是一種多功能的胞質(zhì)蛋白，為鏈接自噬機(jī)制與泛素化蛋白的關(guān)鍵調(diào)控因子[14]。細(xì)胞自噬被激活時(shí), p62蛋白可被降解，水平降低。而自噬功能障礙時(shí), p62蛋白則累積在細(xì)胞內(nèi)，水平升高[15]。因此, p62可作為標(biāo)記蛋白反映自噬活性。本研究中, CPSP組小鼠腦組織中Beclin-1表達(dá)下調(diào)、p62表達(dá)上調(diào)，表明CPSP時(shí)自噬水平降低; CPSP小鼠接受電針治療后, Beclin-1表達(dá)上調(diào)、p62表達(dá)下調(diào)，自噬水平升高。由此提示，電針可能通過(guò)促進(jìn)自噬活性減輕CPSP。

SIRT1是NAD+依賴的蛋白去乙?；?，在機(jī)體能量代謝、自噬及抗氧化應(yīng)激等過(guò)程中均具有調(diào)節(jié)作用[16]。研究[17]顯示, SIRT1可通過(guò)活化ULK1和AKT-mTOR等通路激活Beclin-1, 進(jìn)而誘導(dǎo)自噬。還有研究[18]指出，增加SIRT1的表達(dá)可顯著降低p62含量，并促進(jìn)自噬的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示, CPSP組小鼠腦組織中SIRT1表達(dá)下調(diào)，自噬水平降低; EA組小鼠接受電針治療后SIRT1表達(dá)上調(diào)，自噬水平升高; EA+EX527組小鼠經(jīng)EX527處理后, SIRT1表達(dá)下調(diào)，自噬水平降低。由此推測(cè)，電針可能通過(guò)上調(diào)SIRT1表達(dá)增強(qiáng)自噬活性，進(jìn)而減輕CPSP。

綜上所述，電針可能通過(guò)激活SIRT1的表達(dá)促進(jìn)自噬，從而減輕小鼠CPSP。