重建人類表皮模型醫(yī)療器械體外皮膚刺激試驗(yàn)中白細(xì)胞介素-1α和白細(xì)胞介素-8的表達(dá)變化

劉 佳, 范春光, 孫立魁, 趙增琳

(山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局材料器械安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 濟(jì)南, 250101)

表面接觸醫(yī)療器械使用過(guò)程中與人體皮膚接觸，其材料本身和(或)其可瀝濾物可能會(huì)導(dǎo)致皮膚產(chǎn)生刺激反應(yīng)。因此，相關(guān)產(chǎn)品上市前須對(duì)其進(jìn)行皮膚刺激評(píng)價(jià)。根據(jù)ISO10993系列方法，評(píng)價(jià)方法有3種，分別為人體試驗(yàn)、體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)和體外試驗(yàn)，其中常用的是家兔皮膚刺激試驗(yàn)。體外重建人類表皮模型(RhE)皮膚刺激試驗(yàn)是針對(duì)家兔皮膚刺激試驗(yàn)研發(fā)的替代模型[1]。RhE模型是采用人正常角蛋白細(xì)胞體外培養(yǎng)形成的包括基底層、棘層、顆粒層和有功能的角質(zhì)層在內(nèi)的三維皮膚模型[1]。RhE模型體外皮膚刺激試驗(yàn)是將試驗(yàn)樣品置于模型表面孵育一定時(shí)間后清除，再檢測(cè)模型中細(xì)胞的活性，與陰性對(duì)照相比得到相對(duì)活性(活度)，根據(jù)組織活度預(yù)測(cè)試驗(yàn)樣品的刺激性。該模型被廣泛用于化學(xué)品和化妝品皮膚刺激試驗(yàn)[2], 前期實(shí)驗(yàn)室通過(guò)研究[3]證明該體外皮膚刺激模型也可應(yīng)用在醫(yī)療器械體外皮膚刺激試驗(yàn)中。

白細(xì)胞介素(IL)-1α作為促炎細(xì)胞激動(dòng)素，能夠誘導(dǎo)表皮層角質(zhì)形成細(xì)胞炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[4]。此外，被動(dòng)釋放的IL-1α能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞因子 IL-6和IL-8的表達(dá)[5]。IL-8對(duì)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞具有強(qiáng)烈的趨化作用[6]。研究[7]表明, RhE皮膚刺激模型培養(yǎng)基中IL-1α和IL-8的表達(dá)增加，其可以作為皮膚刺激反應(yīng)的分子標(biāo)記物。本研究針對(duì)國(guó)產(chǎn)化的SkinEthicTMRHE模型在醫(yī)療器械體外皮膚刺激試驗(yàn)方面進(jìn)行研究，選取2種典型的表面接觸醫(yī)療器械產(chǎn)品，采用SkinEthicTMRhE模型試驗(yàn)檢測(cè)其皮膚刺激性，并探討模型中相關(guān)蛋白，尋找出該模型合適的分子標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品: 分別選取水膠體敷料(記為T1)和物理抗菌洗液(記為T2)作為試驗(yàn)樣品。此外，本研究還選取了2個(gè)濃度典型的皮膚刺激陽(yáng)性物質(zhì)乳酸作為效力檢測(cè)樣品。

1.1.2 模型信息: SkinEthicTMRHE模型(上海斯安膚諾生物科技有限公司)。

1.1.3 主要試劑: 組織培養(yǎng)基(上海斯安膚諾生物科技有限公司)、杜氏磷酸鹽緩沖溶液(DPBS, 1×, gibco)、氯化鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司)、芝麻油(ACROS)、20%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液(sigma)、噻唑藍(lán)(MTT, sigma)、異丙醇(滬試)、人IL-1α 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(R&D)、人IL-8 ELISA試劑盒(R&D)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)樣品浸提液制備: 試驗(yàn)組T1, 取水膠體敷料按照3.0 cm2/mL的比例加入極性浸提介質(zhì)(氯化鈉注射液)，于(37.0±1.0) ℃、60轉(zhuǎn)/min震蕩條件下，浸提(72.0±2.0) h制備極性浸提液，記為T1-1; 另取敷料按照相同比例，加入芝麻油，同條件制備非極性浸提液T1-2。試驗(yàn)組T2, 物理抗菌洗液原液不作處理，記為T2。試驗(yàn)組T3, 1.5%和4%的乳酸/氯化鈉注射液溶液，分別記為T3-1和T3-2。介質(zhì)對(duì)照, 對(duì)照按照樣品制備方法同樣處理，分別制備，氯化鈉注射液對(duì)照記為VC-1; 同芝麻油介質(zhì)對(duì)照VC-2。陰性對(duì)照, DPBS不作處理作為陰性對(duì)照，記為NC。陽(yáng)性對(duì)照, 氯化鈉注射液配制的1%的SDS極性陽(yáng)性對(duì)照，記為PC-1; 芝麻油制備1%的SDS非極性陽(yáng)性對(duì)照，記為PC-2。

1.2.2 體外RhE模型培養(yǎng): 將預(yù)孵育后小室轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入1 mL培養(yǎng)基的6孔板中，吸取100 μL試驗(yàn)液或?qū)φ找褐糜诿總€(gè)模型表皮表面(重復(fù)3孔)，培養(yǎng)箱中孵育(24.0±2.0) h。孵育后，使用無(wú)菌DPBS沖洗小室內(nèi)組織，去除殘留樣品，對(duì)模型進(jìn)行MTT檢測(cè)。使用酶標(biāo)儀選擇570 nm波長(zhǎng)濾光片讀取光密度(OD)值。

1.3 數(shù)據(jù)計(jì)算及試驗(yàn)接受準(zhǔn)則

計(jì)算6個(gè)空白對(duì)照孔OD值均值。其余各孔OD值均扣除空白均值得修正值。計(jì)算每塊組織經(jīng)修正的OD值均值。將NC組均值設(shè)為100%活度。每塊組織修正OD值均值除以NC組OD值均值得到每塊組織活度。再計(jì)算各組組織活度均值即為各組組織活度。陰性對(duì)照和介質(zhì)對(duì)照組3塊組織OD均值≥0.8～<2.8, 且3塊組織活度的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)≤20%; 介質(zhì)對(duì)照組活度為80%～120%, 且陽(yáng)性對(duì)照組活度<40%; 3塊組織活度的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)≤20%。試驗(yàn)樣品組3塊組織活度的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)≤20%。

結(jié)果判定: 試驗(yàn)組活度≤50%, 即表示刺激反應(yīng)陽(yáng)性(I)。采用浸提液進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，其中一種介質(zhì)浸提液顯示陽(yáng)性結(jié)果(活度≤50%且SD≤20%)則認(rèn)為此醫(yī)療器械/材料有刺激性(I)。

ELISA檢測(cè) IL1α、IL-8含量: 孵育24 h后，收集小室下的培養(yǎng)基，按照試劑盒規(guī)定的操作步驟測(cè)定IL-1α和IL-8的含量，計(jì)算蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以平均值表示，行t檢驗(yàn);P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體外RhE試驗(yàn)

研究結(jié)果顯示，使用RhE模型進(jìn)行體外刺激試驗(yàn)中，試驗(yàn)樣品水膠體敷料和物理抗菌洗液皮膚刺激指數(shù)為均0, 為無(wú)刺激反應(yīng); 1%乳酸皮膚刺激指數(shù)為0, 為無(wú)刺激反應(yīng); 4%乳酸皮膚刺激指數(shù)為I, 顯示為有刺激反應(yīng)，見(jiàn)圖1。組織病理學(xué)顯示，陽(yáng)性對(duì)照組上皮細(xì)胞變性壞死。4%乳酸組上皮細(xì)胞萎縮，角質(zhì)層脫落。其他組上皮組織織未見(jiàn)明顯異常，見(jiàn)圖2。

NC: DPBS陰性對(duì)照組; VC-1: 氯化鈉注射液對(duì)照組; VC-2: 芝麻油對(duì)照組; PC-1: 1%的SDS極性陽(yáng)性對(duì)照液組; PC-2: 1%的SDS非極性陽(yáng)性對(duì)照組; T1-1: 水膠體敷料極性浸提介質(zhì)(氯化鈉注射液)組; T1-2: 水膠體敷料非極性浸提介質(zhì)(芝麻油)組; T2: 物理抗菌洗液原液組; T3-1: 1.5%乳酸/氯化鈉注射液溶液; T3-2: 4%乳酸/氯化鈉注射液溶液。圖1 RhE體外皮膚刺激模型組織活度

RhE模型蘇木精-伊紅(HE)染色結(jié)果,放大倍數(shù)為200倍。A: DPBS陰性對(duì)照組; B: 氯化鈉注射液對(duì)照組; C: 1%的SDS極性陽(yáng)性對(duì)照液組; D: 1%的SDS非極性陽(yáng)性對(duì)照組; E: 水膠體敷料極性浸提介質(zhì)(氯化鈉注射液)組; F: 水膠體敷料非極性浸提介質(zhì)(芝麻油)組; G: 物理抗菌洗液組; H: 4%乳酸/氯化鈉注射液溶液。圖2 RhE模型組織病理學(xué)圖片示例

2.2 體外RhE模型體外皮膚刺激試驗(yàn)培養(yǎng)基中IL-1α表達(dá)結(jié)果

ELISA結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)基中IL-1α表達(dá)均高于相應(yīng)介質(zhì)對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001); 水膠體敷料極性(氯化鈉注射液)浸提實(shí)驗(yàn)組IL-1α表達(dá)與氯化鈉注射液對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 水膠體敷料非極性(芝麻油)浸提實(shí)驗(yàn)組IL-1α表達(dá)與芝麻油對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。物理抗菌洗液原液組IL-1α表達(dá)與氯化鈉注射液對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。1.5%、4.0%乳酸組與氯化鈉注射液對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05), IL-1α與皮膚刺激指數(shù)呈正相關(guān)，見(jiàn)圖3。

ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RhE模型培養(yǎng)基中IL-1α的表達(dá)情況。NC: DPBS陰性對(duì)照組; VC-1: 氯化鈉注射液對(duì)照組; VC-2: 芝麻油對(duì)照組; PC-1: 1%的SDS極性陽(yáng)性對(duì)照液組; PC-2: 1%的SDS非極性陽(yáng)性對(duì)照組; T1-1: 水膠體敷料極性浸提介質(zhì)(氯化鈉注射液)組; T1-2: 水膠體敷料非極性浸提介質(zhì)(芝麻油)組; T2: 物理抗菌洗液原液組; T3-1: 1.5%乳酸/氯化鈉注射液溶液組; T3-2: 4%乳酸/氯化鈉注射液溶液組。與相應(yīng)的介質(zhì)對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。圖3 體外RhE模型體外皮膚刺激試驗(yàn)培養(yǎng)基中IL-1α表達(dá)結(jié)果(n=3)

2.3 體外RhE試驗(yàn)培養(yǎng)基中IL-8表達(dá)結(jié)果

ELISA結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)基中IL-8表達(dá)均低于相應(yīng)介質(zhì)對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.001); 水膠體敷料極性、非極性浸提實(shí)驗(yàn)組IL-8表達(dá)與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。物理抗菌洗液原液組IL-8表達(dá)與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。1.5%、4.0%乳酸實(shí)驗(yàn)組IL-8表達(dá)低于氯化鈉注射液對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01), 見(jiàn)圖4。

ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RhE模型培養(yǎng)基中IL-8的表達(dá)情況。NC: DPBS陰性對(duì)照組; VC-1: 氯化鈉注射液對(duì)照組; VC-2: 芝麻油對(duì)照組; PC-1: 1%的SDS極性陽(yáng)性對(duì)照液組; PC-2: 1%的SDS非極性陽(yáng)性對(duì)照組。T1-1: 水膠體敷料極性浸提介質(zhì)(氯化鈉注射液)組; T1-2: 水膠體敷料非極性浸提介質(zhì)(芝麻油)組; T2: 物理抗菌洗液原液組; T3-1: 1.5%乳酸/氯化鈉注射液溶液; T3-2: 4%乳酸/氯化鈉注射液溶液; 與相應(yīng)的介質(zhì)對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。圖4 體外RhE模型體外皮膚刺激試驗(yàn)培養(yǎng)基中IL-8表達(dá)結(jié)果(n=3)

3 討 論

針對(duì)醫(yī)療器械浸提液體外刺激試驗(yàn)進(jìn)行的國(guó)際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)研究[8-9]驗(yàn)證了RHE模型能夠有效地評(píng)價(jià)醫(yī)療器械皮膚刺激反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)RHE模型也進(jìn)行了大量研究，證明該模型能夠應(yīng)用于醫(yī)療器械皮膚刺激替代試驗(yàn)。既往研究[10-11]表明，在使用體外皮膚刺激模型研究空氣污染物刺激性實(shí)驗(yàn)中, IL-1α和IL-8表達(dá)均增加，其可以作為敏感的分子標(biāo)記物，提示相關(guān)的皮膚刺激性。但也有研究認(rèn)為，對(duì)皮膚刺激性物質(zhì)和致敏性物質(zhì)刺激RHE模型后, IL-1α和IL-8表達(dá)情況有所不同。當(dāng)局部用致敏物質(zhì)孵育時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外 IL-1α水平非常低，但會(huì)引起明顯的細(xì)胞毒性，其IL-8的釋放量最大。但只存在皮膚刺激物下，作者觀察到反向的細(xì)胞因子釋放譜，并認(rèn)為IL-8、IL-1α和MTT在皮膚刺激試驗(yàn)中都是必要的，可以用來(lái)區(qū)分物質(zhì)的刺激性和致敏性[12]。在本研究中，對(duì)試驗(yàn)液孵育24 h后培養(yǎng)基中的IL-8表達(dá)含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-8在組織活度低的培養(yǎng)基中含量很低，在組織活度高的培養(yǎng)基中的含量基本一致。由于本研究模型主要檢測(cè)皮膚刺激物對(duì)SkinEthicTMRHE模型的刺激作用，而文獻(xiàn)檢索也表明IL-8的表達(dá)與致敏性相關(guān)性更高。分析結(jié)果認(rèn)為, IL-8與皮膚刺激性關(guān)系不大，但可能與該模型檢測(cè)致敏性物質(zhì)有關(guān)。本研究結(jié)果表明，體外皮膚刺激模型培養(yǎng)基中IL-1α的表達(dá)含量隨試驗(yàn)樣品刺激性的增加而增加。與本實(shí)驗(yàn)室前期MTT法中測(cè)得的吸光度情況相比，體現(xiàn)出更高的敏感性。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室前期家兔刺激試驗(yàn)結(jié)果也顯示, IL-1α表達(dá)能夠更為敏感地監(jiān)測(cè)出皮膚刺激反應(yīng)。另一方面，對(duì)于臨界值不好判斷的結(jié)果，應(yīng)該結(jié)合MTT結(jié)果和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，防止出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。

綜上所述，醫(yī)療器械體外皮膚刺激試驗(yàn)中, RhE模型體外皮膚刺激試驗(yàn)中，培養(yǎng)基中IL-1α表達(dá)量與刺激指數(shù)呈正相關(guān)，和IL-8與皮膚刺激指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。IL-1α可作為RhE模型體外皮膚刺激試驗(yàn)的分子標(biāo)記物，提高醫(yī)療器械刺激試驗(yàn)體外替代模型的準(zhǔn)確性。