食管癌中Six1的表達及意義

李曉芳,趙 敏,肖 芳,張詩匯 (.承德醫(yī)學院研究生院,河北 承德 067000；.秦皇島市第一醫(yī)院,河北 秦皇島 066000)

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，我國食管癌的患病人數(shù)從1990 年的254 169例增加至498 410例，食管癌新發(fā)病人數(shù)從 1990 年的173 687例增加至2019年278 121例[1]。食管癌的病理分型主要分為鱗狀細胞癌和腺癌，其中以鱗狀細胞癌最常見。食管癌患者早期多無明顯癥狀，晚期可表現(xiàn)為進行性吞咽困難。近年來，隨著胃鏡發(fā)展，使得食管癌早期診斷率有所提高，使患者得以早發(fā)現(xiàn)早治療。食管癌治療以手術(shù)切除為主，輔以化療、放療及多學科聯(lián)合治療等，但患者的5年生存率仍僅為20%～30%[2]。因此，深入研究食管癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，探索新的相關(guān)分子標志物，對食管癌的防治及預后具有重要意義。

Six1是同源盒基因Six家族的一員，是發(fā)育的主要調(diào)控因子，對正常組織和器官發(fā)育至關(guān)重要[3]。在胚胎發(fā)育早期，Six1在很多組織和器官，如肌肉、腦、腎臟等組織和器官廣泛表達。近年來研究表明，在人類多種腫瘤中如胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌等存在Six1的異常表達，并通過增強腫瘤細胞的增殖、侵襲遷移能力等參與惡性腫瘤發(fā)展進程[4-7]。目前關(guān)于Six1在食管鱗狀細胞癌中的研究較少，本研究通過檢測Six1在食管鱗狀細胞癌中的表達以及其與臨床病理特征的關(guān)系，探討Six1在食管癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1材料：回顧性分析2016年1月～2020年10月秦皇島市第一院病理科確診的食管鱗狀細胞癌56例，食管高級別上皮內(nèi)瘤變47例，食管低級別上皮內(nèi)瘤變39例，正常食管黏膜組織61例。排除標準：①其他組織學類型食管癌；②患者術(shù)前經(jīng)過放療或者化療；③患者患有其他惡性腫瘤、重大臟器疾病或嚴重免疫系統(tǒng)疾病;④臨床資料不全。Six1(C104244,工作濃度1∶150)抗體購自SIGMA公司。

1.2方法：免疫組化所有入選標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色。免疫組化采用Elivision兩步法染色，切片常規(guī)脫蠟至水，EDTA(pH 8.0)抗原修復液高壓修復1.5 min，0.3% H2O2封閉10 min，一抗4℃過夜，用PBS代替一抗做陰性對照，二抗室溫30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后蘇木素復染，樹膠封片。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.3結(jié)果判讀：所有病例的HE切片及免疫組化染色結(jié)果均經(jīng)科內(nèi)2位以上高年資主任醫(yī)師獨立判讀。免疫組化染色結(jié)果的判讀采用雙評分半定量法：染色強度無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色或棕褐色為2分；陽性細胞百分比<5%時，記為0分；陽性細胞百分比為5%～25%時，記為1分；陽性細胞百分比為25%～50%時，記為2分，陽性細胞百分比為50%～75%時，記為3分；當陽性細胞百分比>75%時，記為4分。當染色強度評分×陽性細胞百分比評分≥5分時，為免疫反應(+)，否則為(-)。

1.4統(tǒng)計學分析：采用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩個/多個樣本率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1Six1的表達：Six1表達于細胞核，正常食管黏膜組織中基底細胞陽性。上皮內(nèi)瘤變組織中基底層至全層Six1散在陽性。食管癌組織中，Six1在腫瘤細胞中彌漫強陽性表達。正常食管黏膜(15/61)陽性、低級別上皮內(nèi)瘤變(23/39)陽性、高級別上皮內(nèi)瘤變(36/47)陽性、食管癌(44/56)陽性。食管癌組織中Six1陽性表達率顯著高于正常食管黏膜及上皮內(nèi)瘤變組織(P<0.05)。見圖1～4,表1。且從正常黏膜到癌組織，陽性表達率逐漸升高。

2.2食管癌中Six1的表達與臨床病理特征的關(guān)系：食管癌中Sxi1的表達與患者性別、年齡、腫物最大徑無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1 正常食管黏膜組織中基底細胞Six1陽性(×100)

圖2 低級別上皮內(nèi)瘤變組織中上皮層Six1散在陽性(×100)

圖3 低級別上皮內(nèi)瘤變組織中上皮層Six1散在陽性(×40)

圖4 食管癌組織中Six1彌漫強陽性(×100)

表1 Six1在不同食管組織中的表達(n)

表2 食管癌中Six1表達與其臨床病理特征的關(guān)系(n)

3 討論

同源盒基因Six1，屬Six轉(zhuǎn)錄因子家族。Six蛋白最早發(fā)現(xiàn)于果蠅復眼，從無脊椎動物到人類高度保守。在脊椎動物中，Six家族可分為三個亞組:Six1/Siχ2(So)、Six3/Six6(Optix)和Six4/Six5(Dsix4)。Six1定位于人染色體14q23上，其Six同源結(jié)構(gòu)域(HD， 60個氨基酸)和Six結(jié)構(gòu)域(SD，110～115個氨基酸)高度保守[8]。Six1是發(fā)育的主要調(diào)控因子，對正常組織和器官發(fā)育至關(guān)重要，如肌肉、腎、聽覺系統(tǒng)，感覺器官和顱面結(jié)構(gòu)等。在胚胎發(fā)育早期，Six1在多種組織和器官，如肌肉、腦、腎臟等組織和器官廣泛表達，待發(fā)育成熟后，Six1表達降低或消失。在胚胎發(fā)育初期，Six1丟失或表達異常，可引起各個器官的發(fā)育異常，如人鰓-耳-腎綜合征(BOR)，目前普遍認為是由于Six1突變，導致EYA1-Six1-DNA復合物形成障礙所致[9]。

近年來，在人類多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)Six1的異常表達，Six1在接受其上游基因調(diào)控的同時也調(diào)節(jié)其下游靶基因，參與多種通路、機制來促進腫瘤的發(fā)生及進展。曹燕飛等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-185 可以靶向Six1基因，進而促進肺癌細胞EMT。早在2006年，Ng等[11]就發(fā)現(xiàn)，在肝細胞癌(HCC)組織中，Six1過表達，且其與靜脈浸潤、晚期病理腫瘤轉(zhuǎn)移(pTNM)期和較差的總生存率相關(guān)。在其接下來的實驗中，又進一步證實在HCC中，shRNA抑制Six1表達可抑制MHCC97L細胞的增殖及侵襲能力、降低F-actin聚合，并在G2/M期調(diào)控中發(fā)揮作用，從而抑制肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[12]。

本研究中提示Six1在食管癌的發(fā)生過程中起到一定作用。進一步分析食管癌組織中Six1陽性表達與食管癌的臨床病理特征的關(guān)系。提示Six1參與食管癌的進展過程，且初步證明Six1與食管癌的侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究結(jié)果與上述Six1在其他腫瘤中的表達有相似之處，總的來說，Six1在腫瘤組織中過表達，促進腫瘤的進展。但是本研究仍存在不足，在接下來的研究中，將進一步擴大樣本數(shù)，在定性的基礎上進行定量實驗，設計體內(nèi)、體外實驗，逐步深入其致癌機制的研究。

綜上所述，Six1可能參與并促進食管癌的發(fā)生與進展，此后，將逐步深入探討其相關(guān)機制，希望為食管癌的防治提供新的可能分子機制。