丁基苯酞調(diào)控BDNF/ERK1/2-CREB通路對(duì)慢性酒精中毒大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

姚本海，劉海軍，張 霞,鄭永素 (遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

慢性酒精中毒(CA)是一個(gè)由神經(jīng)生物機(jī)制和環(huán)境因素共同引起的復(fù)雜的多因素疾病，慢性酒精中毒發(fā)病率逐年升高，在全球病死和致殘的危險(xiǎn)因素中，其僅次于高血壓和吸煙因素，位列第三[1]。研究表明長期酗酒者使血清BDNF水平明顯降低[2]。據(jù)研究酒精中毒小鼠中縫核區(qū)BDNF mRNA水平和海馬區(qū)BDNF蛋白水平下降，酒精可下調(diào)BDNF的表達(dá)[3]。許多研究表明腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)元可塑性調(diào)節(jié)的重要因子，具有促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育、生長和分化、防止神經(jīng)元凋亡等多種生理功能[4-5]。BDNF-ERK/CREB信號(hào)通路在維持中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能的同時(shí)，在神經(jīng)分化和突觸功能中起重要作用，也有助于學(xué)習(xí)，記憶形成和維護(hù)[6-7]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)信號(hào)途徑與細(xì)胞的增殖生長密切相關(guān)，參與調(diào)解突觸和神經(jīng)元的可塑性。ERK1和ERK2是ERK的兩種亞型。ERK1/2-CREB是介導(dǎo)BDNF細(xì)胞活性的重要途徑，其主要通過促進(jìn)BDNF對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)揮抗損傷和促生長的作用。ERK1/2和CREB的磷酸化水平是反映信號(hào)通路活性的重要指標(biāo)[8]。研究表明CREB是ERK信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)，CREB的磷酸化伴隨著ERK激活的上調(diào)[9]。CREB是BDNF的上游轉(zhuǎn)錄因子，CREB磷酸化最終導(dǎo)致BDNF的表達(dá)，BDNF在大腦的神經(jīng)調(diào)節(jié)中具有活躍的功能[10]。本課題研究設(shè)想NBP對(duì)慢性酒精中毒大鼠是否通過調(diào)控BDNF/ERK1/2-CREB通路起保護(hù)作用，以期為慢性酒精中毒治療尋找新的藥物。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組:清潔級(jí)健康SD雄性大鼠28只，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，體重300～330 g。所有采購老鼠到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(Control，n=6)、慢性酒精中毒大鼠模型組(Model，n=8)、NBP高劑量組(NBP high dose，n=6)、NBP低劑量組(NBP low dose，n=8)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.1.2主要藥物、試劑、儀器：丁苯酞軟膠囊(NBP，石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司)、無水乙醇(西隴科技股份有限公司)、大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)試劑盒(MM-0209R1,酶免)、大鼠白細(xì)胞介素12(IL-12/P70)試劑盒(MM-0140R1,酶免)、大鼠γ干擾素(IFN-γ)試劑盒(MM-0198R1,酶免)、Trizon Reagent(CW0580S,CWBIO 康為世紀(jì))、Ultrapure RNA 超純RNA提取試劑盒(CW0581M,CWBIO 康為世紀(jì))、HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(R223-01,Vazyme 諾唯贊)、2×SYBR Green PCR Master Mix(A4004M,Lifeint 生命互聯(lián))、熒光PCR儀(CFX ConnectTM實(shí)時(shí),伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)、RIPA細(xì)胞裂解液(C1053,北京普利萊基因技術(shù)有限公司)、BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)(CW0014S,康為世紀(jì))、PVDF膜(IPVH00010,Millipore)、封閉專用脫脂奶粉(P1622,北京普利萊基因技術(shù)有限公司)、牛血清白蛋白(BSA)(A8020,索萊寶)、超敏發(fā)光液(RJ239676,賽默飛)、超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)[Chemi DocTM XRS+,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]。

1.2方法

1.2.1模型構(gòu)建：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，除對(duì)照組外，其余各組大鼠連續(xù)給予6%(V/V)酒精溶液飲用28 d，酒精溶液每日9∶00配制、置換，構(gòu)建慢性酒精中毒大鼠模型。28 d后按NBP高劑量(40 mg/kg)和低劑量(10 mg/kg)灌胃給藥14 d，對(duì)照組灌胃等劑量的玉米油(5 ml/kg)。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)：取大鼠海馬組織經(jīng)液氮研磨成粉末，加入Trizol裂解液后再次研磨，收集組織勻漿液以提取總RNA。將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA。利用熒光PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系如下：RNase Free dH2O 9.5 μl、cDNA 1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μl。反應(yīng)步驟如下：預(yù)變性 95℃，10 min；變性95℃，10 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。β-actin作為內(nèi)參，BDNF、ERK1、CREB和和IFN-γ的相對(duì)表達(dá)量根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)所用的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3Western印跡檢測:取大鼠海馬組織經(jīng)液氮研磨成粉末，加入裂解液后再次研磨，將組織勻漿吸入一EP管中，冰上裂解30 min后，12 000 r/min離心15 min，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)2 h，后用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜80 min。一抗溶液孵育，4℃過夜；二抗溶液中室溫孵育2 h。在膜上滴加ECL發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用ImageJ軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)均用Graphpad Prism7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間的顯著性差異經(jīng)方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組IFN-γ、BDNF、ERK1、CREB mRNA表達(dá)比較:與對(duì)照組相比，模型組IFN-γ mRNA表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；BDNF、ERK1 mRNA表達(dá)水平明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但CREB mRNA表達(dá)水平增高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。與模型組相比，使用NBP高劑量和低劑量治療后明顯降低IFN-γ mRNA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而BDNF、ERK1 mRNA升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但CREB mRNA表達(dá)水平未升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。見表2。

2.2各組IL-12、IFN-γ、BDNF、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB蛋白表達(dá)比較:與對(duì)照組相比，模型組中IL-12、IFN-γ顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；BDNF、p-ERK1/2和p-CREB顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，NBP高劑量和低劑量治療后降低IL-12和IFN-γ的蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；上調(diào)BDNF、p-ERK1/2和p-CREB的蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3、圖1；其中高劑量的NBP效果更佳。

表2 各組IFN-γ、BDNF、ERK1、CREB mRNA表達(dá)比較

表3 各組IL-12、IFN-γ、BDNF、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB蛋白表達(dá)比較

圖1 各組IL-12、IFN-γ、BDNF、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB的蛋白條帶

3 討論

長期過量飲酒會(huì)導(dǎo)致消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生嚴(yán)重衰竭[11-15]。持續(xù)性飲酒是影響大腦的重要因素，包括情緒和行為的改變以及判斷缺陷、學(xué)習(xí)障礙和記憶障礙。在1984年的一項(xiàng)研究表明，在首次入院治療時(shí)隨機(jī)選擇的住院慢性酗酒者中，68%有認(rèn)知障礙，74%有周圍神經(jīng)病變，24%有自主神經(jīng)功能失調(diào)的證據(jù)，所有這些都被認(rèn)為與長期飲酒有關(guān)[16]。

根據(jù)WHO 2014年《全球酒精與健康狀況報(bào)告》，全球人口中有38.3%飲酒，其中我國在2010～2012年15歲及以上居民34.3%飲酒，一生中酒精依賴和酗酒的患病率分別為12.5%和17.8%；在過去的20年，由于酒精的濫用，全球死亡率增加30%，每天有15人或每96 min有一人死于飲酒；有害使用酒精每年導(dǎo)致300多萬人死亡，每20人中有1人死亡，酒精的有害使用造成全球疾病負(fù)擔(dān)增加5%以上[17-18]。

Climent等[19]證實(shí)酒精可降低BDNF的表達(dá)，從而抑制其受體功能以及與細(xì)胞存活相關(guān)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)信號(hào)通路，影響神經(jīng)元的生長、分化及生存。長期大量飲酒可以導(dǎo)致炎性反應(yīng)因子:IL-1b、IL-6、IFN-γ和TNF-α等增加[20]。BDNF基因的缺乏導(dǎo)致了小鼠酒精攝入量的增加[21]。據(jù)報(bào)道BDNF治療可降低腦內(nèi)細(xì)菌組誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，增加抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)[22]。NBP的主要藥理作用包括重建微循環(huán)，保護(hù)線粒體功能，抑制氧化應(yīng)激，抑制炎性反應(yīng)和抑制神經(jīng)元凋亡[23]。研究發(fā)現(xiàn)NBP能激活ERK1/2介導(dǎo)的EGFR通路，使CREB和ELK1的轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而促進(jìn)BDNF的表達(dá)；NBP除了促進(jìn)BDNF的表達(dá)外，還促進(jìn)表皮生長因子(EGF)的表達(dá)；這兩種神經(jīng)營養(yǎng)因子可能激活Trk受體，進(jìn)而激活ERK1/2及其下游效應(yīng)子；因此，以ERK1/2為中心，可能啟動(dòng)一個(gè)正反饋回路，增強(qiáng)NBP的作用；NBP通過激活多種生長因子介導(dǎo)的信號(hào)通路，促進(jìn)OGD/R損傷下的神經(jīng)生成和神經(jīng)元存活[24]。

本文對(duì)慢性酒精中毒大鼠通過予以NBP高劑量、低劑量灌胃后使IFN-γ mRNA減低，BDNF、ERK1 mRNA增高；減低IL-12、IFN-γ 蛋白，BDNF、p-ERK1/2、p-CREB蛋白升高；但在CREB mRNA變化上無意義，可能與實(shí)驗(yàn)條件、溫度、操作等有關(guān)，望在以后的實(shí)驗(yàn)中加大樣本量、嚴(yán)格PCR實(shí)驗(yàn)流程標(biāo)準(zhǔn)，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。綜上分析，NBP可能激活BNDF/ERK1/2-CREB信號(hào)通路，對(duì)CA大鼠神經(jīng)保護(hù)作用，為臨床運(yùn)用NBP治療慢性酒精中毒性腦病提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。