離子色譜法在中藥化學(xué)成分分析中的應(yīng)用進(jìn)展

頡東妹，魏晗婷，王寧麗，劉建飛，郭 玫，邸多隆

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室/甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗室，甘肅 蘭州 730000)

離子色譜(ion chromatography，IC)是基于離子性化合物與固定相表面離子性功能基團(tuán)之間的電荷相互作用,從而實(shí)現(xiàn)離子性物質(zhì)分離和分析的色譜方法，最初常用于測定樣品中的陰陽離子，后來發(fā)展到測定樣品中的糖類、有機(jī)酸堿、氨基酸等，是一種新型高效液相色譜技術(shù)[1].IC法簡單快速、靈敏度高、選擇性好、能同時分析多種離子化合物，其分離模式分為離子交換色譜(HPIC)、離子排斥色譜(HPIEC)和離子對色譜(MPIC).HPIC應(yīng)用離子交換的原理，采用低交換容量的離子交換樹脂來分離離子，這在離子色譜中應(yīng)用最廣泛，適用于中藥中陰陽離子的分析.HPIEC的分離機(jī)理主要是離子排斥，分離介質(zhì)與化合物間被假定存在一層Donnan膜，強(qiáng)酸電解質(zhì)向填料滲透時被膜排斥，而弱酸電解質(zhì)可穿透膜進(jìn)入填料，因此產(chǎn)生了色譜保留，適用于中藥中有機(jī)酸、無機(jī)弱酸及醇類的分析.MPIC是基于待測組分在分析柱上的吸附作用不同的原理進(jìn)行分離，適用于具有表面活性的陰陽離子和金屬配合物的分析[2-4].

近年來，IC法在中藥分析中的應(yīng)用主要包括金屬離子、無機(jī)陰離子、有機(jī)酸類、糖類等成分的檢測.本文綜述了近年來國內(nèi)外離子色譜技術(shù)在中藥化學(xué)成分分離分析中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為中藥分析工作提供借鑒.

1 IC法在中藥金屬離子分析中的研究進(jìn)展

中藥中的金屬元素主要為堿金屬、堿土金屬、重金屬以及過渡金屬離子等，這些金屬元素對中藥中多種生物分子的活性起到關(guān)鍵調(diào)控作用，例如酶的催化活性、蛋白質(zhì)的合成及功能穩(wěn)定、神經(jīng)傳導(dǎo)、肌肉運(yùn)動和營養(yǎng)物質(zhì)的代謝[5].

2 IC法在中藥二氧化硫殘留分析中的研究進(jìn)展

中藥飲片在加工和流通貯存過程中，硫磺熏蒸或浸泡是中藥飲片漂白、保濕、防蟲的傳統(tǒng)加工方法之一[11].但近年來中藥材的硫磺熏蒸濫用現(xiàn)象已對用藥安全造成了嚴(yán)重影響，過量二氧化硫會對人體的心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、肺組織、生殖系統(tǒng)等產(chǎn)生不同程度的損傷[12].因此，測定中藥材中因硫磺熏蒸或浸泡而產(chǎn)生的亞硫酸鹽殘留量對于保證中藥材質(zhì)量和用藥安全具有非常重要的意義.

目前，國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014檢測中藥材及飲片中亞硫酸鹽殘留量(以二氧化硫計)的限量為不得超過100 mg/kg[13].中華人民共和國藥典2020版檢測中藥材及飲片中亞硫酸鹽殘留量(以二氧化硫計)的限量為不得超過150 mg/kg[14].常規(guī)方法耗時、選擇性差、測定過程中使用的乙酸鉛對實(shí)驗室環(huán)境造成污染，并對實(shí)驗人員造成潛在的危害.李梅花等[15]比較了酸堿滴定、IC法測定中藥制劑中的二氧化硫殘留量的適用性及結(jié)果.離子色譜條件為使用Thermo Scientific陰離子色譜柱，0.010 74 mol/L氫氧化鈉滴定液為淋洗液，1.0 mL/min流速，測得平均回收率為83.09%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.53%.酸堿滴定法測定的結(jié)果高于離子色譜法.IC法靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性高，適用于驗證方法.酸堿滴定法由于其自身方法的限制，重復(fù)性偏差較大，滴定結(jié)果誤差較大，樣品組分多樣，其中一些揮發(fā)性酸對結(jié)果有很大影響，更加適用于中藥制劑中二氧化硫殘留量的初篩.王欣美等[16]使用IonPac AS11-HC型離子交換柱測定甘草、制天南星和金銀花等多種中藥中二氧化硫殘留量，所用淋洗液為15 mmol/L KOH，流速為1.0 mL/min，測得3種中藥中二氧化硫殘留量分別為93.1、162.0、129.9 mg/kg，檢測限為0.53 mg/kg，平均回收率為103.7%.傳統(tǒng)方法(碘量法和堿量法)需專門制作全玻璃蒸餾裝置，且取樣量大(10 g以上)，蒸餾時間長(1 h以上)，誤差較大，準(zhǔn)確性不高.而IC法測定中藥中二氧化硫的方法取樣量少(2 g以內(nèi))，耗時短(30 min以內(nèi))，采用儀器方法進(jìn)行前處理和檢測，具有可控性和專屬性強(qiáng)、誤差小、靈敏度和準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn).滕南雁等[17]使用IonPac AS11-HC色譜柱測定中藥西瓜霜硫酸鹽的含量，以30 mmol/L氫氧化鈉為淋洗液，流速為1.0 mL/min，測得硫酸鹽的含量在89.99%～91.67%之間.傳統(tǒng)的硫酸鋇重量法操作復(fù)雜，耗時長，采用離子色譜測定硫酸根，操作簡便，靈敏度和準(zhǔn)確度高，平均加樣回收率達(dá)到99.9%，可對含硫酸鹽的中藥材及其制劑的檢測提供高效率的方法.IC法在測定中藥材及其制劑的二氧化硫殘留時具有靈敏度高、操作簡便、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，近年來已被廣泛使用.目前IC法是測定二氧化硫殘留量較好的方法，可準(zhǔn)確測定當(dāng)歸等中藥材中二氧化硫的殘留量，為制定相關(guān)的殘留量國家標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持[18].

3 IC在中藥無機(jī)陰離子分析中的研究進(jìn)展

4 IC法在中藥有機(jī)酸分析中的研究進(jìn)展

5 IC在中藥糖類物質(zhì)分析中的研究進(jìn)展

糖類是自然界廣泛存在的重要的有機(jī)化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫等多種生物活性.由于糖類物質(zhì)的紫外吸收十分微弱，直接采用紫外檢測器-HPLC法測定糖類成分，靈敏度較低[33].示差檢測器-HPLC法雖然可以解決糖類成分紫外吸收弱，導(dǎo)致靈敏度較低的問題，但該方法檢測限較低[34].高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法具有操作簡便、準(zhǔn)確度和靈敏度高、無需衍生等優(yōu)點(diǎn)，目前，一般采用該類方法對糖類含量進(jìn)行分析[35].

5.1 中藥單糖分析

李藝等[36]使用Dionex CarboPac PA200分析柱分離測定糊精中的還原糖，以純化水為流動相A，0.25 mol/L NaOH溶液為流動相B，0.25 mol/L醋酸鈉溶液為流動相C，流速為0.4 mL/min.該方法樣品制備簡單，靈敏度和準(zhǔn)確度高，所測成分之間的分離度好，平均回收率分別為98.4%、99.2%、100.9%、98.9%、99.1%.傳統(tǒng)重量法影響結(jié)果的因素較多，如煮沸反應(yīng)時間、過濾、洗滌、干燥等步驟都可能對結(jié)果造成影響，而IC法簡單快速且專屬性較高，排除了人為操作對結(jié)果的影響.Cataldi等[37]使用CarboPac PA1分析柱檢測乳制品中的單糖與雙糖含量，堿性淋洗液在使用前，用氦氣沖洗約20 min，將用于洗脫劑制備的純水脫氣，加入適量標(biāo)記的無碳酸50% NaOH，將洗脫液保存在塑料容器中，并用Dionex洗脫組織劑(EO1)使其飽和，使CO2吸附量最小化，流速為1.0 mL/min，所采用的洗脫液組成可以為所選樣品提供最佳分離，而不受基質(zhì)組分的干擾.Xu等[38]采用高效陰離子交換色譜與電噴霧電離質(zhì)譜相結(jié)合法，CarboPacPA1分析柱對果膠中的單糖進(jìn)行分析，單碳水合物分析使用10 mmol/L NaOH溶液(0～25 min)作為淋洗液，二碳水合物分析使用100 mmol/L NaOH(25～45 min)作為淋洗液，流速為0.30 mL/min，柱子的流出液中加入含有機(jī)溶劑的鞘液，可以提高電噴霧電離質(zhì)譜對糖的靈敏度.

5.2 中藥寡糖分析

寡糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)造血功能、抗氧化、抗抑郁、抗腫瘤、抗炎菌、抗病毒、降血糖和免疫增強(qiáng)等多種藥理、生理活性.熊建飛等[39]建立陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法，采用METROSEP CARB 1陰離子交換柱測定了玄參中水蘇糖的含量，淋洗液為30 mmol/L NaOH，流速為1.0 mL/min，峰面積的RSD為0.56%～9.01%，加標(biāo)回收率在96.52%～109.56%之間.該方法預(yù)處理簡單，準(zhǔn)確度高，適用于快速測定中藥中的低聚寡糖.

5.3 中藥多糖分析

中藥多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境、抗氧化等作用，建立含有多糖類成分的中藥分析方法，是中藥現(xiàn)代化質(zhì)量控制水平提高的有效措施[40].樂勝鋒等[41]采用水提醇沉法提取蘆薈鮮葉中的多糖，經(jīng)三氟乙酸水解，利用Dionex CarboPac PA10高效陰離子色譜柱色譜柱分離，氫氧化鈉梯度淋洗，流速為1.0 mL/min，建立了蘆薈多糖中巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖7種常見單糖的測定方法，加標(biāo)回收率為97.5%～102.5%，實(shí)現(xiàn)了蘆薈多糖中7種單糖的分離和定量分析.IC法無需進(jìn)行衍生化操作，簡單且靈敏度高，為單糖的定性定量分析及多糖的單糖組成分析提供了一種快速可靠的方法.Xie等[42]采用Carbo PACTMPA10分析柱測定青錢柳多糖中的單糖組成，淋洗液為12.5 mmol/L NaOH，流速為0.25 mL/min.試驗結(jié)果表明，青錢柳多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖組成，物質(zhì)的量之比為1.00∶1.85∶3.26∶3.12∶0.85∶0.29，建立的高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測器(HPAEC-PAD)法簡單、快速、靈敏.該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是不需要標(biāo)記分析物進(jìn)行檢測，極大簡化了樣品清理過程，縮短了總分析時間，樣品不需要衍生化且運(yùn)行時間僅20 min.經(jīng)驗證該方法具有良好的線性(R2為0.998 7～0.999 9)，精確度高(RSD<3.8%)、靈敏度高(2.57～7.86 nmol/L).試驗結(jié)果表明所建立的方法非常適合于多糖的測定，也可用于同時測定其他單糖組成的多糖測定.何連軍等[43]采用超聲輔助水浴提取多花黃精粗多糖，經(jīng)硫酸水解后，采用CarboPac PA1色譜柱測定其多糖中單糖的組成，采用梯度洗脫，淋洗液為250 mmol/L NaOH溶液，流速為1.0 mL/min，經(jīng)驗證該方法的加樣回收率為88.36%～111.3%，測得各單糖在1～100 mg/L線性關(guān)系良好(r>0.999)，最低檢出限為0.015～0.025 mg/L，RSD為1.35%～2.80%.試驗建立的HPAEC-PAD法不需將糖衍生化，操作簡便，分離效果好，靈敏度高，可用于多花黃精中多糖的單糖組成的分析.

6 總結(jié)

IC在中藥化學(xué)成分分析的應(yīng)用如表1所列.從現(xiàn)有的文獻(xiàn)可以看出，目前IC法主要應(yīng)用于中藥中金屬離子、無機(jī)陰離子、有機(jī)酸和糖類成分的研究.

表1 IC在化學(xué)成分分析中的應(yīng)用

續(xù)表1

基于中藥基質(zhì)的復(fù)雜性，近年來離子色譜技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用愈加廣泛.與傳統(tǒng)分析方法相比，離子色譜技術(shù)在中藥金屬離子、無機(jī)陰離子、有機(jī)酸、糖類等成分的分離分析中表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢.展望未來，預(yù)期離子色譜技術(shù)的重要發(fā)展方向：一是離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將成為中藥分離分析和結(jié)構(gòu)鑒定應(yīng)用與研究中的重要方法.二是新型離子色譜柱的研究將為離子色譜更廣泛的應(yīng)用提供支撐.三是離子色譜技術(shù)在中藥學(xué)方面的研究將會受到重視.