固定化對(duì)功能菌群DDMZ1脫色效果及群落結(jié)構(gòu)的影響

謝學(xué)輝, 趙江貴, 方英榮, 秦 艷，陳小光，楊珊珊, 宋新山, 劉 娜，張慶云

(1.東華大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院/國(guó)家環(huán)境保護(hù)紡織工業(yè)污染防治工程技術(shù)中心/中國(guó)紡織工業(yè)聯(lián)合會(huì)紡織行業(yè)污染治理與減排技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620；2.上海污染控制與生態(tài)安全研究院，上海 200092；3.宿州學(xué)院 環(huán)境與測(cè)繪工程學(xué)院，安徽 宿州 234000；4.安徽工程大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

0 引 言

“衣”“食”“住”“行”被稱(chēng)為人類(lèi)的四大基本需求，其中 “伴衣而生”的紡織行業(yè)是我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的傳統(tǒng)支柱型產(chǎn)業(yè)和民生產(chǎn)業(yè)。然而，紡織制造工藝中會(huì)產(chǎn)生大量染料廢水，這些廢水具有高色度、高鹽度、高化學(xué)需氧量(COD)和酸堿性強(qiáng)等特點(diǎn)，處理難度高[1]。在所有已知的染料中，偶氮類(lèi)染料是應(yīng)用最廣泛的一種，約占工業(yè)染料的2/3，它是指含有一個(gè)或以上偶氮基(—N=N—)并連接有至少一個(gè)芳香結(jié)構(gòu)的染料[2-3]，這類(lèi)染料廢水水質(zhì)復(fù)雜,有機(jī)物成分含量高,可生化性差，其不完全降解可能產(chǎn)生苯胺類(lèi)物質(zhì)[4],會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成巨大危害。

目前，對(duì)染料廢水的處理主要采用物理處理法、化學(xué)處理法和微生物處理法等[5]。其中物理處理法和化學(xué)處理法主要采用絮凝、混凝、吸附和膜過(guò)濾等方法。這些方法并不能很好地去除水中的染料及其降解中間產(chǎn)物，且在處理過(guò)程中均會(huì)產(chǎn)生大量的污泥，造成二次污染的同時(shí)也會(huì)增加處理成本[5-6]。相比之下，微生物處理法是一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、高效的染料廢水處理技術(shù)[7]。利用微生物(細(xì)菌、真菌等)的代謝作用去除廢水中的有機(jī)物質(zhì)，作用條件溫和，去除效率高，不會(huì)造成二次污染[8]。CAO等從當(dāng)?shù)匾患胰旧珡S分離出一種名為YHK的菌群，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該菌群對(duì)磺化偶氮染料(DB2)的脫色效率達(dá)90%以上[9]。此類(lèi)微生物處理法降解染料廢水的研究還有很多[10-12]。

通常情況下，微生物降解染料廢水的能力與微生物的活性直接相關(guān)。然而，由于制造工藝的多樣性，染料廢水的性狀往往波動(dòng)較大，其中重金屬、鹽度、pH和溫度等會(huì)影響微生物的活性[9]，降低微生物降解效率。微生物固定化技術(shù)有望解決這一問(wèn)題。相比游離態(tài)的微生物，固定化后的微生物具有密度高、耐毒、處理效率高等優(yōu)勢(shì)[13-15]。已有許多有關(guān)微生物固定化技術(shù)的研究，如： CAI等使用聚乙烯醇-海藻酸鈣-活性炭固定分離出的芽孢桿菌JF4，且JF4-固定化珠10 d內(nèi)對(duì)100 mg/L活性藍(lán)19染料的脫色效率接近100%，而相同條件下游離的芽孢桿菌JF4在12 d內(nèi)脫色效率僅為92.1%[16]。DURRUTY等利用天然植物材料絲瓜絡(luò)作為載體固定真菌，形成絲瓜絡(luò)-真菌系統(tǒng)用于偶氮染料直接黑22號(hào)脫色，固定化后的真菌生長(zhǎng)速度是游離化真菌的9倍，脫色效率增加了2倍[17]。

本研究采用課題組前期從水解酸化反應(yīng)器污泥樣品中馴化篩選得到的天然功能菌群DDMZ1做固定化，分析對(duì)比了經(jīng)聚乙烯醇-海藻酸鈉-沸石固定化的DDMZ1小球與游離化DDMZ1菌液對(duì)偶氮染料活性黑5的脫色效果。同時(shí)分別對(duì)游離化DDMZ1菌液和循環(huán)使用20次與30次的固定化DDMZ1小球進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析，探究其微生物組成的差異性。研究結(jié)果對(duì)于了解聚乙烯醇-海藻酸鈉-沸石復(fù)合固定化材料對(duì)功能菌群DDMZI的脫色效果和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響有指導(dǎo)作用。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料和儀器設(shè)備

1.1.1 功能菌群DDMZ1

功能菌群DDMZ1是由本課題組通過(guò)濃度梯度壓力馴化法從上海松江污水處理廠二沉池的活性污泥中篩選得到。該菌群在兼氧、37 ℃、pH為5.5時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，生長(zhǎng)速率較快且延遲期短(約2 h)，可迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以進(jìn)行染料代謝活動(dòng)[4，18]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(溶劑：去離子水，其中KH2PO42.66 g/L，NH4Cl 0.2 g/L，無(wú)水硫酸鈉 0.5 g/L，Yeast extract 3 g/L)

交聯(lián)劑：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4%的CaCl2飽和硼酸溶液。

上述所有培養(yǎng)基和交聯(lián)劑均在115 ℃滅菌30 min后冷卻備用。

聚乙烯醇1 750±50 (滬試)、人造沸石(20～40目)(CP)、氫氧化鈉(AR)、硼酸和 25% 戊二醛(GR)，均購(gòu)自國(guó)藥；Sodium alginate(AR，購(gòu)自上海生工)；活性黑5(RB5,購(gòu)自Sigma-Aldrich)；無(wú)水氯化鈣 AR,購(gòu)自GENERAL-REAGENT?)；丙酮(GR,購(gòu)自永華化學(xué))。

1.1.3 儀器設(shè)備

恒溫磁力攪拌器(Feb-85，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(HPX-9052MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DGG-9030DB，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；立式高壓蒸汽滅菌器(LDZM-40L-I，上海申安醫(yī)療器械廠)；超聲波清洗器(KQ-100B，昆山市超聲波儀器有限公司)；磁力攪拌加熱鍋(ZNCL-GS型190*90，上海越眾儀器設(shè)備有限公司)；微量紫外分光光度計(jì)(2166型，IMPLEN)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 游離化DDMZ1菌液的制備

取1 mL保存于-80 ℃的DDMZ1濃縮液接種于100 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱(兼氧pH=5.5、37 ℃)中進(jìn)行活化培養(yǎng)[19]。培養(yǎng)48 h后，取10 mL培養(yǎng)液接種到90 mL新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)2代后達(dá)到菌群的穩(wěn)定生長(zhǎng)期。再次取10 mL穩(wěn)定生長(zhǎng)的菌液接種到90 mL新鮮培養(yǎng)基中，即制得游離化DDMZ1菌液。

1.2.2 固定化DDMZ1小球的制備

固定化DDMZ1小球制備方法依照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行，使用聚乙烯醇(PVA)和海藻酸鈉(SA)作為菌液包埋載體，并添加沸石作為吸附劑。具體操作如下：室溫下在燒杯中用去離子水溶解SA(1%)；另備一只燒杯倒入適量去離子水并置于96 ℃水浴鍋中，加入PVA(8%)攪拌使其溶解；接著用一次性注射器分別取10 mL SA溶液和PVA溶液，將二者混合均勻后制成20 mL含有SA和PVA的包埋液，利用水浴鍋將包埋液溫度控制在37 ℃。隨后，取沸石液加入濕菌體并充分混合均勻，接著取適量沸石混合液加入包埋液中，控制沸石濃度約為2%。最后使用一次性注射器吸取最終混合液，并將注射器懸空置于盛有交聯(lián)劑的燒杯正上方約10 cm處，緩慢滴入60 mL混合液至交聯(lián)劑中。交聯(lián)固定一定時(shí)間以后，使之形成直徑較為均勻的小球，用生理鹽水沖洗2～3次后密封于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 脫色實(shí)驗(yàn)

將10 mL游離化DDMZ1菌液和體積相近的一定數(shù)量固定化DDMZ1小球分別放入含有90 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的錐形瓶中，加入RB5使其最終質(zhì)量濃度為100 mg/L。密封后放入恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，于24、48、72 h分別取2 mL樣品離心(12 000 r/min, 4 ℃)10 min后測(cè)定上清液在597 nm波長(zhǎng)的吸光度，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。按照式(1)計(jì)算不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的脫色率(D)。

D=(A0-At)/A0×100%

(1)

式中：A0為染料溶液脫色前的吸光度值；At為染料溶液脫色t時(shí)的吸光度值。

1.2.4 固定化功能菌群DDMZ1群落結(jié)構(gòu)

采用高通量測(cè)序方法分析固定化技術(shù)及固定化后循環(huán)使用批次對(duì)DDMZ1菌群微生物群落多樣性的影響。

1) DNA抽提。實(shí)驗(yàn)菌液和固定化小球均在37 ℃下靜置培養(yǎng)，RB5 染料的初始質(zhì)量濃度均為100 mg/L。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種10%(體積比)菌液培養(yǎng)48 h后到達(dá)穩(wěn)定生長(zhǎng)期，抽取樣品記為DDMZ1；在固定化小球循環(huán)使用達(dá)20批次時(shí)抽取樣品記為IMDDMZ11(60 d)；在固定化小球循環(huán)使用達(dá)30批次時(shí)抽取樣品記為IMDDMZ12(90 d)。其中固定化小球樣品需先放在4 ℃冰箱中冷干后，移至超凈工作臺(tái)上用滅菌后的刀片將其粉碎、超聲處理后裝入無(wú)菌離心管中以待檢測(cè)。用土壤 DNA 提取試劑盒E.Z.N.A.? (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)完成基因組DNA抽提后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)。

2) PCR擴(kuò)增和熒光定量。以提取的DNA為模板，使用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)擴(kuò)增16S rDNA基因序列。PCR反應(yīng)參數(shù)依次為：首先在95 ℃下預(yù)解鏈3 min；隨后進(jìn)行循環(huán)：95 ℃解鏈30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，此循環(huán)操作進(jìn)行27次；接著在72 ℃下延伸10 min，并于10 ℃停止。最后將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量。

3) Miseq文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序。通過(guò)PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端；使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物；用Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)；氫氧化鈉變性后產(chǎn)生單鏈的DNA片段；將DNA片段固定在芯片上；PCR擴(kuò)增產(chǎn)生DNA簇，隨后DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈；加入DNA聚合酶(改造后)和dNTP(帶有4種熒光標(biāo)記)；用激光掃描，讀取模板序列上的核苷酸種類(lèi)；將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3′端黏性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸；統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，以獲知模板DNA片段的序列[21-22]。

4) 微生物生物信息分析。高通量測(cè)序后將初始fastq格式的文件用QIIME(Quantitative Insights into Microbial Ecology)質(zhì)控過(guò)濾統(tǒng)計(jì)優(yōu)化序列，使用相同數(shù)量序列以比對(duì)不相同樣品的微生物菌群結(jié)構(gòu)[23]。使用Mothur 1.30.2軟件生成α多樣性指數(shù)和稀釋曲線。并將有效序列用RDP Classifier 2.11軟件序列分類(lèi)注釋?zhuān)捎肦安裝包對(duì)樣品運(yùn)行主成分進(jìn)行分析(PCA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫色效果

游離化DDMZ1菌液和固定化DDMZ1小球?qū)B5偶氮染料脫色效果如圖1所示。

圖 1 游離化DDMZ1菌液與固定化DDMZ1小球脫色效果Fig.1 Decolorization effect of free DDMZ1 bacterialsolution and immobilized DDMZ1 pellets

總體看來(lái)，固定化DDMZ1小球脫色效果優(yōu)于游離化DDMZ1菌液。24 h時(shí)固定化DDMZ1小球脫色率為89.01%，甚至高于72 h時(shí)游離化DDMZ1菌液的脫色率(87.92%)，這表明其脫色速率得到了顯著提升。至72 h時(shí)固定化DDMZ1的脫色率達(dá)到了94.34%，相比游離化DDMZ1菌液提高了6.42%。此外，本課題組前期的研究表明，固定化DDMZ1小球?qū)崿F(xiàn)了微生物與載體材料的多位點(diǎn)結(jié)合，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，大大降低了外部環(huán)境對(duì)微生物細(xì)胞的影響，使得固定化DDMZ1小球可適應(yīng)更加復(fù)雜的工作環(huán)境[20]。因此可推測(cè)，固定化是脫色效率和速率提高的最主要因素，固定化DDMZ1小球在實(shí)際RB5偶氮廢水處理中更具價(jià)值。

2.2 固定化功能菌群DDMZ1群落結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)Illumina MiSeq 高通量微生物多樣性測(cè)序方法分析固定化和循環(huán)使用批次對(duì)功能菌群中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。樣品DDMZ1、IMDDMZ11和IMDDMZ12分別產(chǎn)生了61 598、48 792和58 487個(gè)有效序列數(shù)目，以此序列數(shù)目結(jié)果來(lái)比較測(cè)序結(jié)果。

1) 主成分分析。基于OTU分析不同樣本群落組成可以反映樣本間的差異和距離，PCA主成分分析運(yùn)用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸取能夠最大反映樣品間差異的2個(gè)特征值。樣本物種組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。

圖2為各類(lèi)樣品微生物群落組成的PCA分析結(jié)果，其中第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)分別可以解釋91.86%和8.15%?？梢钥吹?，樣品DDMZ1與IMDDMZ11和IMDDMZ12的直線距離均較遠(yuǎn)，其兩兩之間數(shù)據(jù)投影的PC1和PC2均較大。故可說(shuō)明，樣品DDMZ1相對(duì)另外2組樣品在微生物群落結(jié)構(gòu)上有顯著的差異。而樣品IMDDMZ11和IMDDMZ12在圖中顯示PC1差距較小，且直線距離相對(duì)較近，說(shuō)明IMDDMZ11和IMDDMZ12的微生物群落結(jié)構(gòu)具有一定的差異性，但總體組成較為相似。

圖 2 基于各類(lèi)樣品微生物群落組成的PCA分析Fig.2 PCA analysis of microbial community of various samples

2) 稀釋性曲線。稀釋性曲線可用來(lái)比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度及說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性。采用對(duì)序列隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表各分類(lèi)學(xué)水平的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。

圖3為各類(lèi)樣品OTUs的稀釋性曲線。由圖3知，3個(gè)樣品的稀釋性曲線隨著分析序列數(shù)據(jù)量的增加均呈現(xiàn)逐漸平緩穩(wěn)定的趨勢(shì)。這不僅表明高通量測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，數(shù)據(jù)分析結(jié)果可信度高，更說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)達(dá)到飽和狀態(tài)，能夠覆蓋功能菌群DDMZ1和固定化DDMZ1小球微生物組群落的大范圍物種。

圖 3 各類(lèi)樣品OTUs的稀釋性曲線Fig.3 Rarefaction curves for OTUs of various samples

3) 環(huán)境微生物群落多樣性指數(shù)。樣品中的Chao指數(shù)數(shù)值越大，樣品中群落的豐富度越高。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)則反映樣品中細(xì)菌群落的多樣性，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說(shuō)明微生物的群落結(jié)構(gòu)組成多樣性越豐富，反之則相反[24]。3組樣品的對(duì)應(yīng)指數(shù)如表1所示。

表 1 樣品的微生物多樣性指數(shù)和序列信息

從表1可以看出，在97%的相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果中，樣品DDMZ1、IMDDMZ12和IMDDMZ11分別劃分為13、21和23個(gè)分類(lèi)單元(OTUs)。Coverage 是樣品(克隆)文庫(kù)的覆蓋率，數(shù)值越高，樣品中序列被測(cè)出的概率越高。2組固定化DDMZ1小球的樣品Chao和Shannon指數(shù)均明顯高于游離化DDMZ1菌液樣品，說(shuō)明該菌群經(jīng)固定化后群落的豐富度得到了顯著提高。從循環(huán)使用20批次和30批次的2組樣品IMDDMZ11、IMDDMZ12對(duì)比可看出，樣品IMDDMZ12的Chao指數(shù)略有下降，且Shannon指數(shù)較小，而Simpson指數(shù)略大；這表明循環(huán)批次對(duì)固定化DDMZ1小球的群落豐富度和多樣性有一定的影響。循環(huán)30批次的群落豐富度和群落多樣性均略有下降。但是相差不大，整體趨于穩(wěn)定。

4) 不同分類(lèi)學(xué)水平的固定化微生物群落結(jié)構(gòu)。根據(jù)RDP Classifier分析結(jié)果，可得3個(gè)樣品序列以門(mén)、綱、科和屬水平劃分的群落物種結(jié)構(gòu)組成情況。根據(jù)群落Bar圖可直觀得出不同分類(lèi)學(xué)水平上各樣品的微生物種類(lèi)及樣品中各微生物的相對(duì)豐度(所占比例)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

(a) 門(mén)水平

(b) 綱水平

(c) 科水平圖 4 不同分類(lèi)學(xué)水平上3個(gè)樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Microbial community analysis in three samples at different levels

圖4表明3個(gè)樣品間的微生物群落結(jié)構(gòu)組成和豐富度具有明顯差異。在群落組成門(mén)的分類(lèi)水平上，3個(gè)樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)組成顯現(xiàn)出相似的多樣性而差異化的豐度，見(jiàn)圖4(a)。變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteriota)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)和脫硫菌門(mén)(Desulfobacterota)是其檢測(cè)出的五大菌門(mén)。變形菌門(mén)(Proteobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)是游離化DDMZ1菌液樣品的兩大優(yōu)勢(shì)菌群，這一檢測(cè)結(jié)果與本課題組之前的檢測(cè)結(jié)果及在厭氧或兼氧條件下可降解脫色染料相一致[25]。而在固定化DDMZ1小球分別循環(huán)使用20次和30次的樣品檢測(cè)中出現(xiàn)了特有的擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)、放線菌門(mén)(Actinobacteriota)和脫硫菌門(mén)(Desulfobacterota)。循環(huán)使用20次的樣品IMDDMZ11其主要優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)；循環(huán)使用30次樣品IMDDMZ12優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)和放線菌門(mén)(Actinobacteriota)?？煽闯鰳悠稩MDDMZ12中放線菌門(mén)(Actinobacteriota)的豐度較樣品IMDDMZ11明顯提高，其他3種優(yōu)勢(shì)菌群的豐度略有降低。有研究表明在好氧顆粒污泥處理實(shí)際印染廢水中擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)是其優(yōu)勢(shì)菌門(mén)[26]，厭氧/好氧反應(yīng)器降解直接染料中放線菌門(mén)(Actinobacteriota)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)等優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)染料的脫色降解起主要作用[27]。

此外，將甲基紅、甲基橙、茜黃素R鈉鹽、金橙I和混合染料作為Winogradsky模擬的反應(yīng)器中的染料廢水，用序批式間歇補(bǔ)料運(yùn)行方式污泥對(duì)其進(jìn)行脫色降解，分離出的微生物組成群落中擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)是優(yōu)勢(shì)菌群，其次是厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)，印染廢水降解中厚壁菌門(mén)能在極端環(huán)境因子下生長(zhǎng)，且經(jīng)多種染料馴化后的污泥里，該菌依舊存在[28]。實(shí)驗(yàn)中功能菌群DDMZ1經(jīng)復(fù)合載體固定化循環(huán)降解RB5偶氮染料(初始質(zhì)量濃度100 mg/L) 20次后，微生物群落多樣性和厚壁菌門(mén)的豐度得到了顯著提升，為處理染料廢水尋找高效混合菌群及其固定化提供研究應(yīng)用依據(jù)。

圖4(b)呈現(xiàn)出3個(gè)樣品在群落組成綱的分類(lèi)水平上的微生物群落相對(duì)豐度。變形菌門(mén)的γ-變形菌(Gammaproteobacteria)在DDMZ1樣品中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，占比約為80%，但在IMDDMZ11和IMDDMZ12樣品中的其相對(duì)豐度所占比例明顯減少，僅約為45%和38%。厚壁菌門(mén)的芽孢桿菌綱(Bacilli)在3個(gè)樣品的菌群相對(duì)豐度中相差不大，它被證明可降解蒽醌和甲基紅染料[29]。但擬桿菌門(mén)的擬桿菌綱(Bacteroidia)、厚壁菌門(mén)的梭菌綱(Clostridia)和脫硫菌門(mén)的脫硫桿菌綱(Desulfobacterota)在IMDDMZ11樣品中依次增加了約20%、7%和2%；在IMDDMZ12樣品中增加量依次約為15%、7%和1.5%，此外 IMDDMZ12樣品中放線菌門(mén)的放線菌綱(Actinobacteria)豐度大幅增加，增加量約為樣品DDMZ1的13%。結(jié)果表明，固定化DDMZ1小球的微生物群落多樣性較游離化DDMZ1菌液增加，且隨著降解RB5染料的循環(huán)批次增加，放線菌綱(Actinobacteria)的豐度得到提升，并使得該菌群結(jié)構(gòu)組成所占的相對(duì)豐度更趨均勻化。

在群落組成科的分類(lèi)水平上共檢測(cè)到22種菌，結(jié)果如圖4(c)所示。在3個(gè)樣品中共有的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的相對(duì)豐度較大，鼠孢菌科(Sporomusaceae)相對(duì)豐度較小。腸球菌科(Enterococcus)的相對(duì)豐度在樣品DDMZ1中較小，在IMDDMZ11和IMDDMZ12中較大，有研究表明其降解RR198染料(初始質(zhì)量濃度10～25 mg/L)的脫色率高于98%[30]。在樣品DDMZ1中黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)是其第二優(yōu)勢(shì)菌群，還有少量的產(chǎn)堿菌科(Alcaligenaceae)和假單胞菌科(Pseudomonadaceae)，該菌可用于生物絮凝劑，使活性嫩黃K-4G和活性翠藍(lán)KN-G 等可溶性的活性染料絮凝沉淀[31]。而在樣品IMDDMZ11和IMDDMZ12中檢測(cè)出特有的梭菌科(Clostridiaceae)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)、兼性厭氧菌科(Dysgonomonadaceae)、鏈球菌屬(Streptococcaceae)和脫硫桿菌屬(Desulfovibrionaceae)等，兩者群落結(jié)構(gòu)組成相似度高，其中樣品IMDDMZ12中鏈球菌屬(Streptococcaceae)豐度較大。總之，3個(gè)樣品的群落結(jié)構(gòu)組成和相對(duì)豐度表明固定化DDMZ1小球相比游離化DDMZ1菌液顯著地改變了其微生物群落結(jié)構(gòu)組成和相對(duì)豐度，且固定化DDMZ1小球群落組成穩(wěn)定性高，循環(huán)使用批次對(duì)其微生物群落結(jié)構(gòu)組成的影響較小，僅存在部分菌種的豐度變化。

圖5為3個(gè)樣品中屬的Heatmap圖，其中每個(gè)矩形的色塊顏色展示一個(gè)樣品中菌屬的豐富度。

圖 5 3個(gè)樣品中屬的Heatmap圖Fig.5 Heatmap of the genera in all three samples

從圖5可看出，樣品DDMZ1與IMDDMZ11和IMDDMZ12微生物群落結(jié)構(gòu)組成在屬的分類(lèi)平上差異顯著。其中，樣品IMDDMZ11和IMDDMZ12相似，而樣品DDMZ1單獨(dú)聚類(lèi)。大腸桿菌-志賀菌(Escherichia-Shigella)在3個(gè)樣品中豐度均占優(yōu)勢(shì)，其次是厭氧菌(Anaerospora)。在高毒性的銻污染的水環(huán)境中大腸桿菌-志賀菌(Escherichia-Shigella)的微生物群落相對(duì)豐度較高，是一種潛在修復(fù)銻污染水體和沉積物的菌種[32]。厭氧菌(Anaerospora)能將偶氮染料作為唯一碳源和能源進(jìn)行礦化[33]。在樣品DDMZ1中大腸桿菌-志賀菌(Escherichia-Shigella)和寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)占優(yōu)勢(shì)。而在樣品IMDDMZ11和IMDDMZ12中菌群還富集有兼性厭氧-擬桿菌屬(Dysgonomonas)、腸球菌屬(Enterococcus)、梭菌菌群(Clostridium_sensu_stricto_12)和厭氧菌(Anaerospora)。有研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)水堿質(zhì)量濃度為1 300～1 500 mg/L時(shí)的厭氧反應(yīng)器中兼性厭氧-擬桿菌屬(Dysgonomonas)是其常駐菌屬[34]，說(shuō)明該菌能耐受高堿度的染料廢水。腸球菌屬(Enterococcus)可對(duì)活性紅198偶氮染料脫色和生物降解[30]。梭菌菌群(Clostridium_sensu_stricto_12)能對(duì)染料中的聚乙烯醇(PVA)退漿廢水進(jìn)行降解[35]，而本實(shí)驗(yàn)中PVA是固定化材料之一，該菌群可減少載體材料對(duì)環(huán)境的危害。在樣品IMDDMZ11和IMDDMZ12中還有少量富集的菌群，是在水解酸化反應(yīng)器中降解RB5 和 RBBR染料的主要功能菌屬[22]。如產(chǎn)丙酸單胞菌屬(Propionicimonas)、大腸桿菌屬(Lachnoclostridium)、脫硫孤菌屬(Desulfovibrio)、檸檬酸菌屬(Citrobacter)和乳酸菌屬(Citrobacter)。脫硫孤菌屬(Desulfovibrio)和乳酸菌屬(Citrobacter)。此外，樣品IMDDMZ11中還富集了黃桿菌屬(Flavobacterium)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)。黃桿菌屬(Flavobacterium)可降解廢水中的氯氰菊酯[36]，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)在黑臭河水的治理中起重要作用[37]?？傮w看來(lái)，游離化DDMZ1菌液與固定化DDMZ1小球在屬的分類(lèi)水平上群落結(jié)構(gòu)組成差異明顯；同時(shí)，循環(huán)使用批次對(duì)固定化DDMZ1小球群落結(jié)構(gòu)組成具有一定影響，但總體群落結(jié)構(gòu)組成相似度高。

3 結(jié) 論

1) 在相同條件下，固定化DDMZ1小球?qū)B5偶氮染料的脫色率顯著優(yōu)于游離化DDMZ1菌液，脫色速率也得到了提升。

2) 微生物分類(lèi)學(xué)水平由門(mén)到屬的分析結(jié)果顯示，樣品中游離化DDMZI菌液與固定化DDMZ1小球的微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異明顯，主要表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)菌群的組成和豐度存在較大差異。而固定化DDMZ1小球樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)組成比較相似，雖然循環(huán)使用批次不同會(huì)造成優(yōu)勢(shì)菌屬比例出現(xiàn)不同，但是整體來(lái)說(shuō)固定化小球樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，這表明固定化技術(shù)具有穩(wěn)定微生物群落結(jié)構(gòu)，從而穩(wěn)定脫色效果的作用。

3) 固定化樣品中除了豐度占顯著優(yōu)勢(shì)的菌屬大腸桿菌-志賀菌(Escherichia-Shigella)外，還富集了兼性厭氧-擬桿菌屬(Dysgonomonas)，故推測(cè)這2種占優(yōu)勢(shì)的菌屬在固定化DDMZ1小球循環(huán)使用高達(dá)30批次降解脫色RB5過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。